SPISE. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Det er nylig vist at ascomycete sopp Ilyonectria crassa er i stand til å infisere potetknoller. Dette arbeidet er det første som analyserer de biologiske egenskapene og motstanden mot noen soppdrepende stoffer fra I. crassa-stammen isolert fra poteter. Sekvensene av artsspesifikke regioner av "potetstammen" falt sammen med de som ble oppnådd tidligere for sopp isolert fra røttene til narcissus, ginseng, osp og bøk, liljepærer og tulipanblad. Tilsynelatende kan mange ville planter og hageplanter være reserver av I. crassa. Den undersøkte stammen infiserte tomat- og potetskiver, men smittet ikke hele tomatfrukten og den intakte potetknollen. Dette viser at I. crassa er en sårparasitt. Evaluering av resistens mot fludioxonil, difenoconazol og azoxystrobin på et næringsmedium viste høy effekt av disse medikamentene.
EC50-indikatoren (konsentrasjonen av soppdrepende middel, som bremser med 2 ganger hastigheten for radial vekst av kolonien i forhold til den soppdrepende kontrollen) var lik 0.4; 7.4 og 4 mg / l, henholdsvis. Muligheten for utvikling av sykdommen forårsaket av I. crassa bør tas i betraktning når fytopatologisk vurdering av potetknoller og utvikling av planteverntiltak.
Utviklingen av fytopatogene mikroorganismer fører til store tap i alle faser av dyrking og lagring av poteter. Ved planlegging av beskyttelsestiltak tas det som regel hensyn til kjente patogener, for eksempel arter av slekten Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, etc. Imidlertid har det de siste årene kommet flere og flere rapporter om utseendet til nye fytopatogene mikroorganismer på poteter. Deres biologi er dårlig studert, effektiviteten av soppdrepende midler brukt på poteter i forhold til dem er ukjent, diagnostiske metoder er ikke utviklet. Med masseutvikling er de i stand til å forårsake betydelig skade på potetavlingen. En av disse mikroorganismene er ascomycete-soppen Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, først oppdaget av forfatterne på potetknoller (Chudinova et al., 2019).
Dette arbeidet presenterer resultatene av analysen av I. crassa-stammen isolert fra potetknoller. Morfologien til kolonier og mycelstrukturer av I. crassa, nukleotidsekvenser av artsspesifikke DNA-regioner, virulens mot poteter og tomater og motstand mot noen populære soppdrepere ble studert.
Materialer og metoder
Vi brukte I. crassa 18KSuPT2-stammen isolert i 2018 fra den berørte potetknollen dyrket i Kostroma-regionen. Knollen ble påvirket av en tørr råte med et hulrom dekket med lysebrunt mycelium. Ved bruk av en steril disseksjonsnål ble soppmyceliet overført til en petriskål med et agarmedium (ølurt 10%, agar 1.5%, penicillin 1000 U / ml). Platene ble inkubert i mørket ved 24 ° C.
Et Leica DM2500 lysmikroskop med et ICC50 HD digitalt kamera og et Leica M80 kikkertmikroskop med et IC80HD digitalt kamera (Leica Microsystems, Tyskland) ble brukt til å fotografere, vurdere størrelsen og morfologien til sporer og spororganer.
For å isolere DNA ble soppmyceliet dyrket i flytende ertmedium, deretter frosset i flytende nitrogen, homogenisert, inkubert i CTAB-buffer, renset med kloroform og vasket to ganger med 2% alkohol.
DNA-ekstraksjonsmetoden er beskrevet i detalj i artikkelen av Kutuzova et al. (2017).
For å bestemme arten ved molekylære metoder og sammenligne med andre kjente I. crassa-stammer, ble PCR utført med primere som tillot amplifisering av artsspesifikke DNA-regioner: ITS1-5,8S-ITS2 (primere ITS5 / ITS4, White et al., 1990), genregioner b -tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) og oversettelsesforlengelsesfaktor 1α (tef1α) (primere EF1-728F / EF1-986R, Carbone og Kohn, 1999). Amplikoner med ønsket lengde ble ekstrahert fra gelen ved hjelp av Evrogen CleanUp-settet. De amplifiserte regionene ble sekvensert ved bruk av BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) på en Applied Biosystems 3730 xl automatisert sequencer (Applied Biosystems, CA, USA). De oppnådde nukleotidsekvensene ble brukt til å søke etter en kamp i GenBank-databasen til US National Center for Biotechnology Information (NCBI). Fylogenetisk analyse ble utført ved hjelp av MEGA 6-programmet (Tamura et al., 2013).
Bestemmelse av virulens ble utført på hele grønne frukter av storfruktet tomat (sort Dubrava) og potetknoller (sort Gala). I tillegg, for å simulere skade på skadet frukt og knoll, brukte vi skiver av de samme fruktene og knollene. Skiver av knoller ble plassert i fuktige kamre, som var petriskåler med vått filterpapir i bunnen. Det ble lagt et lysbilde på papiret, som igjen ble lagt knoller eller frukt. Hele knoller og frukt ble også plassert i beholdere med vått filterpapir i bunnen. I midten av skiven (eller på den intakte overflaten av knollen eller frukten) ble et stykke agar (5 × 5 mm) med sopphyfer plassert etter 5 dagers dyrking på wortagar.
Vurderingen av motstanden til soppstammer mot soppdrepende stoffer ble utført under laboratorieforhold på agar næringsmedium. Vi studerte følsomheten for soppdrepende medisiner Maxim, KS (aktiv ingrediens fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenokonazol 250 g / l) (Statskatalog ..., 2020). Evaluering ble utført i petriskåler på urtagarmedium med tilsetning av de undersøkte medikamentene i konsentrasjoner av den aktive substansen 0.1; en; 1 ppm (mg / l) (for fludioksonil og difenokonazol), 10; ti; 1 ppm (for azoxystrobin) og i medier uten soppdrepende middel (kontroll). Fungicidet ble tilsatt til det smeltede mediet, avkjølt til 10 ° C, hvorpå mediet ble hellet i petriskåler. En agarblokk med soppmycelium ble plassert i midten av en petriskål og dyrket ved en temperatur på 100 ° C i mørket. Etter 60 dagers inkubering ble kolonienes diameter målt i to gjensidige vinkelrette retninger; måleresultatene for hver koloni ble gjennomsnittet. Eksperimentene ble utført i tre eksemplarer. Basert på resultatene av analysene ble EC24 beregnet, lik konsentrasjonen av soppdrepende middel, som halverte hastigheten for kolonien radial vekst i forhold til soppdrepende kontroll.
Resultater og diskusjon
På petriskåler med urtagar dannet soppen kolonier med hvitt flokkulent mycelium. Mediet under myceliet ble rødbrunt. Når mediet tørker opp, dannet soppen sporer av to typer på enkle og aggregerte konidioforer i liten sporodokia. Makrokonidier er langstrakte, sylindriske, med en til tre septa, gjennomsnittlig lengde 27.2 um med et verdiområde fra 23.2 til 32.2 mikrometer, bredde - opp til 4.9 mikrometer (fig. 1). Gjennomsnittlig lengde på mikrokonidier er 14.3 µm med et verdiområde fra 10.3 til 18.1 µm, bredden er opptil 4.0 µm. Alle makro- og mikromorfologiske tegn passer inn i variasjonsområdet for arten Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Sekvensene av artsspesifikke DNA-regioner (ITS, b-tubulin, TEF 1α) falt helt sammen med sekvensene til I. crassa-stammene vi studerte tidligere (Chudinova et al., 2019, tabell 1). For å studere forekomsten av I. crassa i andre regioner og analysere spekteret av berørte kulturer, ble lignende DNA-sekvenser i GenBank-databasen analysert (tabell 1). Overlappingen var 86 til 100%. Sekvensene av alle de tre DNA-regionene til "potet" I. crassa-stammen var identiske med sekvensene av stammene isolert fra liljepæren og narcissus-røttene i Nederland og fra ginsengrot i Canada. Vi klarte ikke å finne andre I. crassa-stammer med tre analyserte lignende sekvenser i åpne databaser. Imidlertid viste analyse av de avsatte ITS- og b-tubulinsekvensene tilstedeværelsen av I. crassa på tulipanblader i Storbritannia. Sopp med en lignende ITS-sekvens ble identifisert ved analyse av mykobiota av osprøtter i Canada og bøkrøtter i Italia, og potetknoller i Saudi-Arabia (tabell 1). Resultatene av denne studien viser at I. crassa har en global distribusjon og er i stand til å infisere forskjellige plantearter.
Ved bestemmelse av patogenisiteten på skiver av tomat og potet på 5. dag nådde lesjonens diameter 1.5 cm. Den undersøkte stammen infiserte ikke hele tomatfrukten og den intakte potetknollen. Imidlertid ble kelkbladene påvirket av tomaten. For å utelukke muligheten for forurensning fra myceliet utviklet på potetknollskiven, ble et soppisolat isolert i en ren kultur. Det var helt identisk med foreldrenes belastning. Tilsynelatende er I. crassa en sårparasitt.
Behandling av frøknoller med soppdrepende planter reduserer utviklingen av sykdommer på planter i vekstsesongen. For valg av effektive soppdrepende midler er det viktig å vurdere hvilke av dem som er effektive mot I. сrassa. Arbeidet studerte de utbredte aktive stoffene i soppdrepende midler - fludioxonil, azoxystrobin, difenoconazole. Fludioxonil er formulert i flere blandinger som brukes til å kle frø og frøknoller før planting. Fludioxonil (Maxim) brukes også til å behandle frøknoller før lagring. Difenokonazol og azoksystrobin er også inkludert i en rekke preparater som brukes til prosessering av frømateriale, så vel som i preparater beregnet på prosessering av vegetative planter (State catalog ..., 2020).
Veksthastigheten til I. crassa ble studert på media (figur 2) med forskjellige konsentrasjoner av aktive stoffer: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobin (EC50 = 4 ppm) og difenokonazol (EC50 = 7.4 ppm) (tabell 2). Disse preparatene kan betraktes som svært effektive mot I. crassa, siden EC50 er betydelig lavere enn anbefalt konsentrasjon av preparatet i arbeidsfluidet som brukes til behandling av knoller. I henhold til State Catalog ... (2020) er konsentrasjonen av fludioxonil i væsken for behandling av potetknoller fra 500 til 1000 ppm, azoxystrobin (i væsken for behandling av bunnen av furen) - 3750-9375 ppm, difenokonazol (i væsken for behandling av vegetative planter) - 187.5– 625 spm.
Tabell 1. Likhet med sekvenser av artsspesifikke sekvenser av stamme 18KSuPT2 og stammer av Ilyonectria crassa tilgjengelig i Genbank-databasen
belastning | Vertsanlegg, utskillelsessted | Sekvensnummer deponert i GenBank, prosentandel av likheter | Ссылка | ||
DET ER | β-tubulin | TEF 1α | |||
17KSPT1 og 18KSuPT2 | Potetknoll, Kostroma-regionen | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, dette arbeidet |
CBS 158/31 | Narcissus røtter, Nederland | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Liljepære, Nederland | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Ginsengrot, Canada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Tulipanblad, Storbritannia | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Aspen røtter, Canada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Bøk, Italia | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Direkte innlevering |
KAUF19 | Potetknoll, Saudi-Arabia | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = ikke deponert
Tabell 2. Resistens av Ilyonectria crassa mot soppdrepende midler
(virkestoff) | EC50, ppm | ||||
3 dag | 5 dag | 7 dag | |||
Kontroll | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenokonazol) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
I vårt arbeid ble I. crassa-stammer isolert fra potetknoller i Kostroma og Moskva (Chudinova et al., 2019). En høy andel soppstammer med ITS-sekvenser identiske med I. crassa ble avslørt når man analyserte mykobiota av potetknoller i Saudi-Arabia (Gashgari og Gherbawy, 2013). Tilsynelatende er I. crassa ikke så sjelden på poteter som det kan virke. Våre eksperimenter viste at soppen kunne infisere skadede tomatfrukter. Det er kjent fra litteraturen at I. crassa er i stand til å utvikle seg i jorden saprotrofisk (Moll et al., 2016), så vel som å påvirke en rekke planter, til og med taksonomisk fjerne som påskeliljer, liljer, ginseng, osp og bøk (tabell 1). en). Tilsynelatende kan mange ville planter og hageplanter være reserver av I. crassa. Ovennevnte viser at når man utvikler beskyttelsestiltak, er det nødvendig å ta hensyn til muligheten for å påvirke potetknoller med denne soppen. Utbredte preparater for behandling av potetknoller som inneholder fludioxonil, azoxystrobin og difenoconazol har vist en høy soppdrepende effekt mot I. crassa.
Dette arbeidet ble støttet av den russiske stiftelsen for grunnleggende forskning (tilskudd nr. 20-016-00139).
Artikkelen ble publisert i tidsskriftet "Plant Protection Bulletin", 2020, 103 (3)