D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Den fytopatogene soppen Colletotrichum coccodes forårsaker farlige sykdommer i poteter og tomater kjent som antraknose og knollsvart flekk. Ved morfologiske egenskaper er de ofte vanskelige å skille fra sykdommer forårsaket av andre mikroorganismer; på grønne tomatfrukter kan sykdommen være asymptomatisk og manifesterer seg bare på modne røde frukter. For rask og nøyaktig diagnose av patogenet tilbys et PCR-testsystem i sanntid. For å utvikle et testsystem ble nukleotidsekvensen til glyseroltrifosfatdehydrogenasegenet fra 45 C. bestemt kodestammer isolert fra potetknoller i forskjellige regioner i Russland.
Basert på de oppnådde resultatene og analysen av lignende sekvenser av andre arter som er tilgjengelige i GenBank-databasen, ble artsspesifikke primere og probe for C. coccodes designet. For å teste spesifisiteten til det opprettede testsystemet ble PCR utført med DNA isolert fra rene kulturer av 15 forskjellige arter av parasittiske og saprotrofiske sopp assosiert med tomat- og potetplanter (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Tilstedeværelsen av Colletotrichum coccodes DNA ble bestemt ved en terskelsyklus på 20-27, mens andre arter ble påvist etter 40 sykluser eller ikke ble oppdaget. Testsystemet gjør det mulig å pålitelig påvise C. coccodes DNA-konsentrasjoner over 0.01 ng / mm3 i den analyserte PCR-blandingen. Ved hjelp av det utviklede testsystemet ble tilstedeværelsen av C. coccodes i tomatblader med symptomer på soppsykdommer og i potetknoller uten ytre symptomer på sykdommen undersøkt. Blader med symptomer på soppinfeksjon ble samlet fra to forskjellige felt i Krasnodar-regionen, knoller - fra felt i Kostroma, Moskva, Kaluga, Nizhny Novgorod-regionene. Ett tomatblad som inneholder C. coccodes DNA ble funnet i Krasnodar Territory; en betydelig tilstedeværelse av DNA fra dette patogenet ble påvist i 5 prøver av knoller dyrket i Kostroma, Moskva, Kaluga-regionene.
Innledning
Sopp av slekten Colletotrichum er farlige fytopatogener som påvirker korn, grønnsaker, urter, flerårig frukt og bærplanter. En av de allestedsnærværende artene av denne slekten, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, er det forårsakende stoffet for antraknose og svart flekk av poteter og tomater, og forårsaker sykdommer i en rekke andre planter av Solanaceae-familien, inkl. ugress (Dillard, 1992). C. coccodes påvirker alle underjordiske deler av planten, stammebaser, blader og frukt (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). På skallet av infiserte potetknoller observeres utviklingen av grå flekker med utydelig uttatte kanter, på hvilke svarte prikker av sporulering og mikroskleroti er tydelig synlige. Under lagring kan sår med mykt innhold dannes i knollmasse, dvs. sykdommen går inn i antraknosefasen, som imidlertid er ekstremt sjelden.
Samtidig er symptomene på antraknose (hudsår med små sorte prikker) typiske for tomatfrukter. På bladene vises symptomene på C. coccodes som mørkebrune flekker, vanligvis avgrenset av gult vev (Johnson, 1994).
Utviklingen av svart flekk på knollene ødelegger utseendet, noe som er spesielt uttalt når man selger vasket rødskallpoteter. Peel peeling fører til overdreven fordampning og økte lagringstap (Hunger and McIntyre, 1979). Skader på andre planteorganer fører til tap av utbytte, noe som ble notert i både åpen og lukket bakke (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Sykdommer forårsaket av C. coccodes er vanlige i nesten alle potetproduserende regioner i verden, inkludert Russland (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Kontrollen av disse sykdommene er vanskelig på grunn av utilstrekkelig effektivitet av eksisterende soppdrepende midler mot C. coccodes og mangel på resistente varianter (Read, Hide, 1995).
C. coccodes inokulum kan vedvare i frøknoller (Read and Hide, 1988; Johnson et al., 1997), tomatfrø (Ben-Daniel et al., 2010), overleve lenge i jord, på planteavfall (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) og i ugress (Raid, Pennypacker, 1987). Verkene til en rekke forfattere (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) har vist at sykdomsutviklingen i poteter og tomater i stor grad avhenger av tilstedeværelsen av inokulum i frø og jord. Derfor, for å minimere tapene fra sykdommen, er det nødvendig å diagnostisere (inkludert kvantitative) soppens forplantninger i frømaterialet, i jorden, i frøpotetknollene og tomatfrøene lagt for lagring. Morfologisk diagnostikk i jord og plantemateriale kan bare utføres ved tilstedeværelse av mikrosklerotier, som imidlertid også finnes i andre typer sopp.
Symptomene på knollene ligner veldig på den sølvfargede skorpen forårsaket av soppen Helminthosporium solani. Isolering av Colletotrichum coccodes og Helminthosporium solani i en ren kultur er ganske vanskelig og tar lang tid på grunn av den langsomme veksten på et næringsmedium. For å raskt identifisere Colletotrichum coccodes, er det nødvendig å bruke instrumentelle diagnostiske metoder. Den mest praktiske metoden er polymerasekjedereaksjon (PCR) og dens modifisering - PCR i sanntid. Foreløpig brukes et testsystem utviklet av britiske forskere (Cullen et al., 2002) for ITS1-regionen i rDNA i Europa og USA. Bruken av den har vist gode resultater i analysen av russiske isolater (Belov et al, 2018). C. coccodes er imidlertid svært varierende, og deteksjonen fra en enkelt DNA-sekvens kan føre til falske negative resultater. For en mer pålitelig diagnose er det nødvendig å analysere flere artsspesifikke DNA-sekvenser, i forbindelse med hvilke vi har utviklet et originalt testsystem som lar oss identifisere C. coccodes ved sekvensen til glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenasegenet.
Materialer og metoder
For å vurdere effektiviteten og spesifisiteten til de opprettede testsystemene, brukte vi rene kulturer av 15 sopparter isolert av forfatterne fra syke prøver av tomatblader og frukt, potetknoller (tabell 1). For isolasjon ble plantene tatt med symptomer på soppinfeksjon, ikke mer enn ett organ per busk.
Et stykke knoll med en skall, et stykke tomatfrukt og et berørt blad ble plassert under et kikkertmikroskop, hvorpå mycelium, sporer eller et stykke vev ble overført til et agarmedium (wortagar) i en petriskål med en skjerpet dissekeringsnål. Isolatene ble lagret i agarhelling i reagensglass ved 4 ° C.
Prøver av tomatblader med symptomer på soppsykdommer beregnet på analyse umiddelbart etter oppsamling (i felten) ble plassert i 70% etylalkohol der de ble lagret til DNA-isolasjon. Potetknoller ble levert til laboratoriet, skrelt (2 × 1 cm stykke) fra dem og frosset ved -20 ° C. Lagret frossen til DNA-isolasjon.
Rene soppkulturer for DNA-isolering ble dyrket i flytende ertmedium. Myceliet av soppen ble fjernet fra det flytende mediet, tørket på filterpapir, frosset i flytende nitrogen, homogenisert, inkubert i CTAB-buffer, renset med kloroform, utfelt med en blanding av isopropanol og 0.5 M kaliumacetat og vasket to ganger med 2% alkohol. Det resulterende DNA ble oppløst i avionisert vann og lagret ved -70 ° C (Kutuzova et al., 20). DNA-konsentrasjon ble målt ved hjelp av et HS DNA-kvantifiseringssett for dobbeltstrenget DNA på Qubit 2017 (Qiagen, Tyskland). De alkoholiserte og frosne prøvene ble triturert i flytende nitrogen, etterfulgt av DNA-isolasjon som beskrevet ovenfor (for myceliet av rene soppkulturer).
Tabell 1. Opprinnelsen til de brukte soppstammene
Sopp navn | Plante, orgel | Sted for valg |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | potetknoll | Kostroma-regionen, potetknoller av 1. feltgenerasjon, sort Red Scarlett |
Colletotrichum coccodes 4 | potetblad | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | potetknoll | Magadan-regionen, pos. Telt, potetknoll |
Cladosporium fulvum | tomatblad | Moskva-regionen, storfruktet tomat |
Alternaria tomatophila | tomatfrukt | innsendt av personalet på laboratoriet for mykologi og fytopatologi ved All-Russian Research Institute of Plant Protection |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | tomatfrukt | Krasnodar Territory, Krymsky district, grade Cream |
Fusarium oxysporum | hvete rot | Moskva-regionen |
PCR ble utført på en DTprime-forsterker (DNA-teknologi). For PCR ble originale primere og en sonde for den artsspesifikke regionen av glyseroltrifosfatdehydrogenasegenet brukt: fremover primer Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, omvendt primer Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1. Primerne forsterker en region på 213 bp.
Reaksjonen tok 50 ng totalt DNA (ved analyse av blader og knoller) og 10 ng (ved analyse av DNA fra rene soppkulturer). Reaksjonsblandingen (35 ul) ble separert av et parafinlag i to deler: den nedre (20 ul) inneholdt 2 ul 10x reaksjonsbuffer (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM av hvert deoksynukleotidtrifosfat, 7 pmol av hver primer og 4 pmol av en hydrolyserbar fluorescerende sonde; den øvre inneholdt 1 ul 10 × PCR-buffer og 1 U Taq-polymerase.
Separasjon av blandingen med parafin gjør at rørene kan lagres i lang tid ved en temperatur på 5 ° C og gi en varm start av PCR etter oppvarming i 10 minutter ved en temperatur over 80 ° C. PCR ble utført i henhold til følgende program: 94.0 ° C - 90 s (1 syklus); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 sykluser); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 sykluser); 10.0 ° C - lagring.
Resultater og diskusjon
Glyseroltrifosfatdehydrogenase-gensekvensene ble bestemt i 45 stammer isolert fra blader, stengler, potetknoller og tomatfrukter (Kutuzova, 2018) i forskjellige regioner i Russland. De undersøkte sekvensene av alle stammer ble delt inn i to grupper som var forskjellige i to nukleotider. Nukleotidsekvensene til representanter for begge grupper under nummerene KY2 og KY496634 er deponert i GenBank.
Primerne coc70gdf, coc280gdr og cocgdz-sonden designet på deres basis ble sjekket ved hjelp av BLAST-programmet (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) på alle sekvenser av glyseroltrifosfatdehydrogenasegenet fra arter av slekten Colletotrichum og andre organismer tilgjengelig i GenBank-databasen.
Ingen DNA-regioner av andre organismer som er svært homologe med primere og probe ble funnet.
Sensitiviteten til testsystemet ble sjekket ved hjelp av prøver med forskjellige konsentrasjoner av C. coccodes DNA, DNA fra et potetblad infisert med antraknose (samlet i 2017 i Mari El, sort Red Scarlett) og skall av knoller påvirket av svart flekk (samlet i Kostroma-regionen, sort Red Scarlett, tabell 2). For å bekrefte tilstedeværelsen av DNA i knoller og potetblader, ble C. coccodes-stammer isolert fra dem i rene kulturer.
Resultatene av sensitivitetsanalysen av testsystemet viser at det kan brukes til å diagnostisere tilstedeværelsen av C. coccodes DNA i en prøve når det totale innholdet i PCR-blandingen er mer enn 0.05 ng. Dette er ganske tilstrekkelig for påvisning, siden en sklerotia i gjennomsnitt inneholder 0.131 ng, og en spore inneholder omtrent 0.04 ng DNA (Cullen et al., 2002). Testsystemet utviklet av den britiske gruppen (Cullen et al., 2002) viste lignende følsomhet (terskelsyklus 34 ved 0.05 ng DNA og 37 ved 0.005 ng).
Analyse av naturlige prøver som inneholder C. coccodes gjorde det i alle tilfeller mulig å pålitelig avsløre dets tilstedeværelse i prøven (tabell 2). Den foreslåtte metoden for DNA-isolering var også anvendbar for analysen av naturlige planteprøver.
Tabell 2. Bestemmelse av følsomheten til det foreslåtte testsystemet for identifisering av Colletotrichum-koder for sanntids PCR
Образец | DNA-mengde i prøve *, ng | Terskelsyklus | C. coccodes deteksjon |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Knollskall 1 | 50 | 32 | + |
Knollskall 2 | 50 | 30 | + |
Knollskall 3 | 50 | 31.5 | + |
Potetblad | 50 | 29.5 | + |
Merk. * I en blanding av PCR-produkter.
Testsystemets spesifisitet ble testet på DNA-prøver ekstrahert fra 15 sopparter. Alle soppstammer ble isolert av forfatterne fra berørte og sunne frukter og blader av tomat, potetknoller; en stamme ble isolert fra hveterot (tabell 1). Blant artene som er isolert fra overflaten av frukten, er det også arter som ikke er patogene for tomat (for eksempel Phellinus ferrugineovelutinus).
Studier har vist at C. coccodes DNA ble påvist ved en terskelsyklus på 20–27, mens andre sopparter ikke ble påvist eller ga et signal etter syklus 40, noe som kan tilskrives en ikke-spesifikk støyeffekt (tabell 3).
Tabell 3. Kontroll av testsystemet for forskjellige typer sopp
Sopp navn | Terskelsyklus |
Colletotrichum kokokoder 1 | 20.9 |
C. kokkoder 2 | 22.6 |
C. kokkoder 3 | 23 |
C. kokkoder 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia Solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Merk. * DNA-mengden i alle prøvene var 10 ng.
Det utviklede testsystemet ble brukt til å identifisere C. coccodes i tomatbladprøver med symptomer på nekrotrofiske patogener og settepotetknoller uten synlige symptomer. For studien tok vi frøknoller av forskjellige varianter dyrket i Kostroma, Moskva, Kaluga, Nizhny Novgorod-regionene. Tilstedeværelsen av C. coccodes DNA ble ansett som signifikant i prøvene, i hvilken analysen terskelsyklusen ikke oversteg 35. Denne terskelverdien ble valgt basert på pålitelig bestemmelse av 0.05 ng C. coccodes DNA (terskelsyklus 33.5, tabell 2) og det faktum at terskelsykluser over 40 ble ikke-spesifikt DNA fra noen andre sopparter diagnostisert. Med denne tilnærmingen ble det påvist en betydelig tilstedeværelse av C. coccodes DNA i 5 prøver av knoller dyrket i Kostroma, Moskva, Kaluga-regionene og i ett tomatblad fra Yeisk-distriktet i Krasnodar-regionen (tabell 4, 5).
Tabell 4. Påvisning av Colletotrichum-koder på potetknoller *
Prøvenummer | Utvalg av poteter | Plassering av vekst | C. coccodes deteksjon | Terskelsyklus |
---|---|---|---|---|
1 | Red Scarlet | Kostroma-regionen | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Moskva-regionen | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky tidlig | Moskva-regionen | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Kaluga-regionen | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | fantasy | Kaluga-regionen | - | |
15 | galla | Nizjnij Novgorod-regionen. | - | |
16 | - |
Merk. * DNA-mengden i alle prøvene var 50 ng.
Tabell 5. Påvisning av Colletotrichum coccodes på tomatblader *
Prøvenummer | Plassering av vekst | C. coccodes deteksjon | Terskelsyklus |
---|---|---|---|
1 | Krasnodar-territoriet, Krim-distriktet | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasnodar-regionen, Yeisk-distriktet | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Mengden DNA i alle prøvene var 50 ng.
Testsystemet som er opprettet av oss, er ikke dårligere enn det som ble utviklet av britiske forskere (Cullen et al., 2002) med hensyn til sensitivitet og spesifisitet, og er egnet for analyse av planteprøver. Applikasjonen for analyse av frøknoller gjorde det mulig å identifisere C. coccodes DNA i knoller uten eksterne tegn på skade og å lykkes med å analysere infeksjonen av blader.
Til dags dato har det ikke blitt utført noen analyse av potetknoller for angrep av C. coccodes i Russland. Vår første studie viste at av 16 testede frøknoller dyrket i forskjellige regioner i Russland, inneholder 5 C. coccodes. Dette viser at svart flekk av potetknoller er en vanlig potetsykdom i Russland, og dens rolle i å redusere volumet og kvaliteten på potetavlingen er undervurdert.
Analyse av tomatblader avslørte en betydelig tilstedeværelse av C. coccodes DNA i ett blad fra Yeisk-distriktet i Krasnodar Territory. Tidligere, når man undersøkte tomatfelt i Sør-Russland ved hjelp av det britiske testsystemet (Cullen et al., 2002), ble det funnet blader som inneholder C. coccodes, og i noen felt ble det funnet en høy andel blader infisert med C. coccodes (Belov et al., 2018). I Krasnodar og Primorsky-territoriene, Moskva-regionen, fant vi tomatfrukter, hvorfra vi klarte å isolere rene kulturer av C. coccodes. Det er mulig at C. coccodes er mye mer utbredt på tomat i Russland enn det man nå antar, og dets skadelighet er også undervurdert.
Hittil har det hittil blitt samlet nok informasjon om den brede utbredelsen av C. coccodes på poteter og tomater.
For bedre å forstå denne soppens rolle i utviklingen av potet- og tomatsykdommer, er det nødvendig å overvåke utbredelsen i Russland, studere jord- og frøinfeksjonens rolle og svart flekkens rolle i tap under lagring. Bruk av PCR-diagnostikk kan lette dette arbeidet betydelig, og samtidig bruk av begge testsystemene vil øke nøyaktigheten av analysen betydelig.
Dette arbeidet ble støttet av Russian Science Foundation-tilskudd nr. 18-76-00009.
Artikkelen ble publisert i tidsskriftet "Mycology and Phytopathology" (bind 54, nr. 1, 2020).