S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Dyakov
Innledning
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary - det forårsakende middelet til sen koks, den mest økonomiske sykdommen med poteter og tomater - har vakt nøye oppmerksomhet fra forskere fra forskjellige land i mer enn et og et halvt århundre. Plutselig dukket det opp i Europa på midten av XNUMX-tallet, og forårsaket en potetepidemi som har blitt husket i mange generasjoner.
Inntil nå kalles det ofte "soppen til den irske sulten". Nesten hundre år etter de første epidemiene ble det oppdaget ville meksikanske potetarter som var motstandsdyktige mot sen rødme, metoder for å krysse dem med dyrkede poteter ble utviklet (Muller, 1935), og de første varene mot sen rødme ble oppnådd (Pushkarev, 1937). Rett etter starten av den kommersielle dyrkingen akkumulerte de imidlertid raser av patogenen med senblødning som var virulent mot resistente varianter. og introduksjonen av nye resistensgener fra ville meksikanske poteter i varianter begynte raskt å miste effektiviteten.
Feil ved bruk av monogen (vertikal) motstand tvang oppdrettere til å lete etter mer komplekse måter å utnytte uspesifikk polygen (horisontal) motstand på. De siste årene har svært aggressive løp begynt å akkumuleres i individuelle populasjoner av parasitten, noe som forårsaker erosjon av til og med ikke-spesifikk motstand. Fremveksten av soppdrepende resistente stammer har forårsaket problemer i bruken av kjemikalier for potetbeskyttelse.
På grunn av de betydelige forskjellene mellom oomycetes og sopp i kjemisk sammensetning, ultrastruktur og metabolisme, er soppdrepende midler, spesielt systemiske, som brukes til å beskytte planter mot mange soppsykdommer, ineffektive mot oomycetes.
Derfor ble det anvendt flere ganger (opptil 12 ganger per sesong eller mer) sprøyting med kontaktpreparater med et bredt spekter av handlinger i kjemisk beskyttelse mot sen rødme. Et revolusjonerende trinn var bruken av fenylamider, som er giftige for oomyceter og spres systemisk i planter. Imidlertid førte deres utbredte bruk raskt til akkumulering av resistente stammer i sopppopulasjoner (Davidse et al., 1981), noe som betydelig kompliserte plantevern. P. infestans er praktisk talt den eneste parasitten i den tempererte sonen, hvor skadene i økologisk jordbruk ikke kan nøytraliseres uten bruk av kjemiske beskyttelsesmidler (Van Bruggen, 1995).
Ovennevnte forklarer den enorme oppmerksomheten forskere fra forskjellige land har gitt studiet av P. infestans-populasjoner, dynamikken i overflod og genetisk sammensetning, samt genetiske variabilitetsmekanismer.
Livssyklus til R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans utvikler et intercellulært mycelium med haustoria inne i potetblader. Mating på vevet i bladet, forårsaker dannelsen av mørke flekker, som blir svarte og råtner i vått vær. Med et sterkt nederlag dør hele bladet. Etter en periode med fôring dannes utvekster på myceliet - sporangioforer - som vokser utover gjennom munnhulen. I vått vær danner de en hvit blomst rundt flekkene på undersiden av bladene. I endene av sporangioforene dannes sitronformet zoosporangia som bryter av og bæres av regnspray (fig. 1). Når du kommer inn i vanndråper på overflaten av et potetblad, spirer sporangia med 6-8 zoosporer, som etter en periode med bevegelse er avrundet, dekket med et skall og spirer med et spirerør. Spiren trenger gjennom stomataen inn i bladvevet. Under visse forhold kan sporangia vokse i et vekstrør direkte inn i bladvev. Under gunstige forhold er tiden fra infeksjon til dannelsen av ny sporulasjon bare 3-4 dager.
En gang på bakken og filtrert gjennom jorden, er sporangia i stand til å infisere knoller. Sterkt berørte knoller råtner under lagring; i svakt berørte kan infeksjonen vedvare til neste sesong. I tillegg kan det forårsakende middelet til senblødning vedvare om vinteren i form av oosporer (tykkveggede hvile seksuelle sporer) i jorden på planterester og på tomatfrø. Oosporer dannes på levende organer av planter når stammer av forskjellige typer parring møter overdreven fuktighet. På våren dannes aseksuell sporulering på plantede infiserte knoller og på planterester med oosporer; zoosporer kommer inn i jorden og forårsaker infeksjon i plantens nedre blad. I noen tilfeller kan myceliet vokse fra den infiserte knollen langs den grønne delen av planten og vises vanligvis i den øvre delen av stammen.
En betydelig forskjell mellom oomycetes og de fleste sopp ligger i overvekten av diplofase i deres livssyklus med gametisk meiose og spiring av zygoter (oosporer) uten reduktiv kjernefisjon. Denne funksjonen, pluss dipolar heterotallisme som erstatter biseksualitet, ser ut til å gjøre det mulig å anvende til oomycetes tilnærminger utviklet for å studere populasjoner av høyere eukaryoter (analyse av panmixia og inndeling av populasjoner, intra- og interpopulasjonsgenstrømmer, etc.). Imidlertid tillater ikke tre faktorer fullstendig overføring av disse tilnærmingene i studien av P. infestans-populasjoner.
1. Sammen med hybrid-oosporer dannes selvfertile og parthenogenetiske oosporer i populasjoner (Fife og Shaw, 1992; Anikina et al., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003), og hyppigheten av dannelsen kan være tilstrekkelig til å påvirke på testresultatene.
2. Den seksuelle prosessen i P. infestans gir et ubetydelig bidrag til dynamikken i populasjonsstørrelsen, fordi soppen reproduserer seg hovedsakelig av vegetative sporer og danner mer enn 90% av resultatene av analysen av parringstypen etter den tradisjonelle metoden på et næringsmedium. ... vekstsesongen er flere generasjoner av aseksuell sporulering (polysyklisk sykdomsutvikling). Oosporer spiller en viktig rolle i bevaringen av organismen i perioden hvor det ikke er grønne planter (om vinteren) og i den primære infeksjonen av frøplanter. Deretter, om sommeren, forekommer klonal reproduksjon og en økning eller omvendt en reduksjon i antall individuelle kloner som oppstår som et resultat av seksuell rekombinasjon, som hovedsakelig bestemmes av valget av de mer tilpassede. Derfor kan forholdet mellom individuelle kloner i en populasjon ved begynnelsen og slutten av epifytotika være helt annerledes.
3. Den beskrevne syklusen er karakteristisk for de innfødte populasjonene av P. infestans i deres hjemland, Mellom-Amerika. I andre deler av verden, i mer enn 100 år, var den seksuelle prosessen ikke kjent; det vegetative myceliet i infiserte potetknoller var overvintringsstadiet. Livssyklusen var fullstendig agamisk, og spredningen var i fokus: infeksjonen fra enkeltinfiserte plantede knoller gikk over til bladene og danner primærfokus for sykdommen, som kan smelte sammen med den enorme utviklingen av sykdommen.
Således kan det i noen regioner være en veksling av seksuelle og aseksuelle sykluser, mens i andre - bare aseksuell syklus.
Opprinnelse til P. INFESTANS
P. infestans dukket opp i Europa på slutten av første halvdel av 1991-tallet. Siden poteten er hjemmehørende i den nordøstlige delen av Sør-Amerika, ble det antatt at parasitten ble brakt derfra til Europa under oppgangen til chilensk salpeter. Studier som ble utført ved Rockefeller Center potetstasjon i Toluca Valley, Mexico, tvang imidlertid dette synspunktet til å bli revurdert (Niederhauser, 1993, XNUMX).
1. I Toluca-dalen har lokale tuberøse potetarter (Solanum demissum, S. bulbocastanum, etc.) forskjellige sett med gener for vertikal resistens kombinert med et høyt nivå av uspesifikk resistens, noe som indikerer en lang samutvikling med parasitten. Sør-amerikanske arter, inkludert poteter, mangler resistensgener.
2. I Toluca-dalen er det isolater med parringstypene A1 og A2, som et resultat av at den blandede populasjonen av P. infestans er utbredt; mens i hjemlandet til den kultiverte poteten, Sør-Amerika, spres parasitten klonalt.
3. I Toluca-dalen er det årlige alvorlige epidemier med sen rødme. Derfor, blant nordamerikanske forskere (Cornell University), er oppfatningen om Mesoamerica (Mellom-Amerika) som fødested for potetfytofthora etablert (Goodwin et al., 1994).
Søramerikanske forskere deler ikke denne oppfatningen. De tror at den kultiverte poteten og dens parasitt P. infestans har et felles hjemland - de søramerikanske Andesfjellene. De støttet sitt synspunkt ved molekylære studier på analysen av DNA-polymorfier av mitokondriegenomet (mtDNA) og kjernegener RAS og β-tubulin (Gomez-Alpizar et al., 2007). De viste at stammene samlet fra forskjellige deler av verden stammer fra tre divergerende forfedre linjer som (alle tre) finnes i de søramerikanske Andesfjellene. Andes haplotyper er etterkommere av to linjer: isolater av den eldste mtDNA-avstamningen finnes på villvoksende Solanaceae fra Anarrhicomenum-delen i Ecuador, mens isolater av andre linje er vanlige på poteter, tomater og ville nattskygger. I Toluca stammer til og med sjeldne haplotyper bare fra en avstamning, med den genetiske variabiliteten til Toluca-stammene (lav allelfrekvens på enkelte variable steder) indikerer en sterk grunnleggereffekt på grunn av nylig drift.
I tillegg ble en ny art P. andina funnet i Andesfjellene, morfologisk og genetisk lik P. infestans, som ifølge forfatterne peker på Andesfjellene som et hot spot av spesiering i slekten Phytophthora. Til slutt, i Europa og USA, inkluderer P. infestans populasjoner både andinske linjer, mens det bare er en i Toluca.
Denne publikasjonen ba om et svar fra en gruppe forskere fra forskjellige land, som gjorde mye eksperimentelt arbeid for å revidere den tidligere utførte studien (Goss et al., 2014). I dette arbeidet ble for det første mer informative mikrosatellitt-DNA-sekvenser brukt til å studere DNA-polymorfier; for det andre, for analyse av klynging, migrasjonsveier, tidsdivergens hos populasjoner, etc. mer avanserte modeller ble brukt (F-statistikk, Bayesiske tilnærminger osv.), og for det tredje ble en sammenligning ikke bare brukt med den andinske arten P. andina, hvor en hybrid natur ble etablert (P. infestans x Phytophthora sp.) men også med den meksikanske endemiske arten P. mirabilis, P. Ipomoeae og Phytophthora phaseoli, som er genetisk nær P. infestans inkludert i samme klade (Kroon et al., 2012). Som et resultat av disse analysene ble det utvetydig vist at rotdelen av det fylogenetiske treet av alle arter av slekten Phytophthora tatt med i studien, bortsett fra hybrid P. andina, tilhører meksikanske stammer, og migrasjonsstrømmen har retning Mexico - Andes, og ikke omvendt, og begynnelsen sammenfaller med den europeiske kolonisering av den nye verden (for 300-600 år siden). Dermed oppstod fremveksten av P. infestans-artene som spesialiserte seg for tap av poteter i det sekundære genetiske sentrum for dannelsen av knollformede solanaceous planter, dvs. i Mellom-Amerika.
Genomet til P. INFESTANS
I 2009 sekvenserte et internasjonalt team av forskere hele P infestans genomet (Haas et al, 2009), hvis størrelse var 240 MB. Dette er flere ganger mer enn hos nært beslektede arter P. sojae (95 Mb), forårsaker rotrot av soyabønner, og P. Ramorum (65 Mb), som påvirker verdifulle treslag som eik, bøk og noen andre. Dataene som ble oppnådd viste at genomet inneholder et stort antall kopier av gjentatte sekvenser - 74%. Genomet inneholder 17797 proteinkodende gener, hvorav hoveddelen er gener involvert i cellulære prosesser, inkludert DNA-replikasjon, transkripsjon og translasjon av proteiner.
En sammenligning av genomene fra slekten Phytophthora avslørte en uvanlig organisering av genomet, bestående av blokker av sekvenser av konserverte gener, der gentettheten er relativt høy og innholdet av gjentatte sekvenser er relativt lavt, og individuelle regioner med ikke-konserverte gensekvenser, med lav gentetthet og høyt innhold av gjentatte regioner. Konservative blokker utgjør 70% (12440) av alle P. infestans proteinkodende gener. Innenfor konservative blokker er gener vanligvis tett fordelt med en gjennomsnittlig intergenisk avstand på 604 bp. I områder mellom konservative blokker er den intergeniske avstanden større (3700 bp) på grunn av en økning i tettheten til repeterende elementer. Effekt sekretoriske gener i hurtig utvikling er lokalisert i genfattige regioner.
Sekvensanalyse av P. Infestans genomet viste at omtrent en tredjedel av genomet tilhører mobile elementer. Genomet til P. infestans inneholder betydelig flere forskjellige transposoner, enn andre kjente genomer. De fleste av P. infestans transposons tilhører sigøynerfamilien.
I genomet til P. infestans er det identifisert et stort antall spesifikke genfamilier som er involvert i patogenese. En betydelig del av dem koder for effektorproteiner som endrer fysiologien til vertsplanten og bidrar til infeksjonen. De tilhører to brede kategorier: apoplastiske effektorer, som virker i de intercellulære rom (apoplaster), og cytoplasmiske effektorer, som kommer inn i celler via haustoria. Apoplastiske effektorer inkluderer utskilt hydrolytiske enzymer slik som proteaser, lipaser og glykosylaser som ødelegger planteceller; hemmere av vertsplanteforsvarsenzymer, og nekrotiserende toksiner som Nep1-lignende proteiner (NPL) og Pcf-lignende små cysteinrike proteiner (SCR).
P. infestans effektorgener er mange og vanligvis større enn ikke-patogene gener. De mest kjente er de cytoplasmatiske effektorene RXLR og Crinkler (CNR). De typiske cytoplasmatiske effektorene til oomycetes er RXLR-proteiner. Alle RXLR-effektorgener som hittil er oppdaget, inneholder den aminoterminale gruppen Arg-XLeu-Arg, hvor X er en aminosyre. Som et resultat av studien ble det antydet at det er 563 RXLR-gener i P. infestans-genomet, som er 60% mer enn i P. sojae og P. ramorum. Omtrent halvparten av RXLR-genene i P. infestans-genomet er artsspesifikk. RXLR-effektorer har et bredt utvalg av sekvenser. Blant dem ble det identifisert en stor og 150 små familier. I motsetning til hovedproteomet er RXLR-effektorgenene vanligvis lokalisert i genfattige og gjentatte rike områder av genomet. De mobile elementene som bestemmer dynamikken i disse regionene fremmer rekombinasjon i disse genene.
Cytoplasmatiske CRN-effektorer ble opprinnelig identifisert i P. infestans-transkripsjoner som koder for peptider som induserer plantevevsnekrose. Siden oppdagelsen har det vært lite kjent om familien til disse effektorene. Analyse av P. Infestans genomet avslørte en stor familie av 196 CRN gener, som er mye større enn P. sojae (100 CRN) og P. ramorum (19 CRN). I likhet med RXLR er CRN modulære proteiner og består av et høyt konservert N-terminal LFLAK-domene (50 aminosyrer) og et tilstøtende DWL-domene som inneholder forskjellige gener. De fleste CRN-er (60%) har et signalpeptid.
Muligheten for forskjellige CRN-er for å forstyrre de cellulære prosessene til vertsplanten er studert. Ved analyse av plantennekrose gjorde fjerningen av CRN2-proteiner det mulig å identifisere den C-terminale regionen bestående av 234 aminosyrer (posisjon 173-407, DXG-domene) og forårsake celledød. Analyse av P. infestans CRN-gener avslørte fire forskjellige C-terminale regioner, som også forårsaker celledød i planten. Disse inkluderer de nylig identifiserte DC-domenene (P. Infestans har 18 gener og 49 pseudogener), samt D2 (14 og 43) og DBF (2 og 1) domener som ligner proteinkinaser. Proteiner fra CRN-domener uttrykt i en plante konserveres (i fravær av signalpeptider) i en plantecelle og stimulerer celledød ved en intracellulær mekanisme. Ytterligere 255 sekvenser som inneholder CRN-domener, fungerer sannsynligvis ikke som gener.
Økningen i antall og størrelse på RXLR- og CRN-effektorgenfamiliene var antagelig på grunn av ikke-allel homolog rekombinasjon og gendublisering. Til tross for at genomet inneholder et stort antall aktive mobile elementer, er det fortsatt ingen direkte bevis for overføring av effektorgener.
Metoder brukt i studien av befolkningsstruktur
Studien av den genetiske strukturen til populasjoner er for tiden basert på analysen av rene kulturer av dens bestanddeler. Analysen av populasjoner uten å isolere rene kulturer utføres også for spesifikke formål, for eksempel for å studere aggressiviteten til en populasjon eller tilstedeværelsen av stammer som er resistente mot soppdrepende stoffer i den (Filippov et al., 2004; Derevyagina et al., 1999). Denne typen forskning innebærer bruk av spesielle metoder, hvis beskrivelse ligger utenfor omfanget av denne gjennomgangen. For den komparative analysen av stammer brukes en rekke metoder, basert både på analysen av DNA-strukturen og på studiet av fenotypiske manifestasjoner. Sammenligningsanalyse av populasjoner har å gjøre med et stort antall isolater, noe som stiller visse krav til metodene som brukes. Ideelt sett bør de oppfylle følgende krav (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- være billig, enkel å implementere, ikke kreve betydelige tidskostnader, være basert på generelt tilgjengelige teknologier (for eksempel PCR);
- må generere et tilstrekkelig stort antall uavhengige kodominant markørfunksjoner;
- har høy reproduserbarhet;
- bruk den minste mengden vev som skal undersøkes;
- være spesifikk for underlaget (forurensningen i kulturen skal ikke påvirke resultatene);
- ikke krever bruk av farlige prosedyrer og svært giftige kjemikalier.
Dessverre er det ingen metoder som tilsvarer alle parametrene ovenfor. For en sammenlignende studie av stammer i vår tid, brukes metoder basert på analyse av fenotypiske trekk: virulens mot potet- og tomatvarianter (potet- og tomatløp), parringstype, spektra av peptidase-isoenzymer og glukose-6-fosfatisomerase, og på analyse av DNA-struktur: lengde polymorfisme restriksjonsfragment (RFLP), som vanligvis suppleres med en hybridiseringsprobe RG 57, analyse av mikrosatellittgjentakelser (SSR og InterSSR), amplifikasjon med tilfeldige primere (RAPD), amplifikasjon av restriksjonsfragmenter (AFLP), amplifikasjon med primere homologe med sekvensene av mobile elementer (for eksempel Inter SINE PCR), bestemmelse av mitokondrie DNA-haplotyper.
Kort beskrivelse av metodene for komparativ studie av stammer brukt i arbeidet med P. Infestans
Fenotypiske markørtrekk
"Potet" løp
"Potet" løp er en ofte undersøkt og brukt markør. "Enkle potet" -løp har ett gen for potetvirulens, "komplekse" - minst to. Black et al. (1953), som oppsummerer alle tilgjengelige data, fant at phytophthora-rase er i stand til å infisere planter med motstandsgenet / -genene som tilsvarer P. infestans virulensgenet / genene, og fant rase 1, 2, 3 og 4 som infiserer planter med henholdsvis gener R1, R2, R3 og R4, dvs. interaksjonen mellom parasitten og verten skjer i henhold til genet for gen-prinsippet. Videre oppdaget Black, med deltagelse av Gallegly og Malcolmson, motstandsgenene R5, R6, R7, R8, R9, R10 og R11, samt de tilsvarende løpene (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Det er omfattende data om rasesammensetningen av patogenet fra forskjellige regioner. Uten å analysere disse dataene i detalj, vil vi bare indikere en generell trend: der varianter med nye motstandsgener eller deres kombinasjoner ble brukt, var det først en viss svekkelse av sen rødme, men deretter oppstod løp med tilsvarende virulensgener og ble valgt og utbrudd av sen rødme ble gjenopptatt. Spesifikk virulens mot de første 4 resistensgenene (R1-R4) ble sjelden observert i samlingene samlet før introduksjonen til dyrking av varianter med disse genene, men antall virulente stammer økte kraftig når patogenet parasiterte på varianter som bar disse genene. Gener 5-11 var derimot ganske vanlig i samlinger (Shaw, 1991).
En studie av forholdet mellom forskjellige raser i vekstsesongen, utført på slutten av 1980-tallet, viste at kloner med lav aggressivitet og 1-2 virulensgener dominerte i befolkningen i begynnelsen av sykdomsutviklingen.
Videre, med utviklingen av sen rødme, reduseres konsentrasjonen av de opprinnelige klonene og antallet "komplekse" løp med høy aggressivitet øker. Forekomsten av sistnevnte ved slutten av sesongen når 100%. Ved lagring av knoller er det en reduksjon i aggressivitet og tap av individuelle virulensgener. Dynamikken til kloneerstatning kan forekomme i forskjellige varianter på forskjellige måter (Rybakova & Dyakov, 1990). Imidlertid viste våre studier i 2000-2010 at komplekse løp finnes helt fra begynnelsen av epifytotika blant stammer isolert fra både poteter og tomater. Dette skyldes sannsynligvis endringer i befolkningen av P. Infestans i Russland.
Innen 1988-1995 nådde hyppigheten av "superraces" med alle eller nesten alle virulensgener i forskjellige regioner 70-100%. Denne situasjonen ble for eksempel bemerket i Hviterussland, i Leningrad og Moskva, i Nord-Ossetia og i Tyskland (Ivanyuk et al., 2002a, 2002b; Polityko, 1994; Schober-Butin et al., 1995).
"Tomat" løp
I tomatkulturer ble det bare funnet to gener med resistens mot sen rødme - Ph2 (Gallegly & Marvell, 1) og Ph1955 (Al-Kherb, 2). Som i tilfelle av potetløpene, skjer interaksjonen mellom tomater og P. infestans på gen-for-gen basis. T1988-løpet infiserer varianter som ikke har resistensgener (de fleste av de industrielt brukte variantene), T0-rase infiserer varianter med Ph1-genet (Ottawa), og T1-rase infiserer varianter med Ph2-genet.
I Russland ble det nesten utelukkende funnet T0 på poteter; T0 hersket på tomater i begynnelsen av sesongen, men senere ble den erstattet av T1-løpet (Dyakov et al., 1975, 1994). Etter 2000 begynte T1 på poteter i mange populasjoner å forekomme helt i begynnelsen av epytytika. I USA var potetstammer ikke-patogene for tomat, så vel som løp T0, T1 og T2, mens T1 og T2 dominerte tomater (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin et al., 1995).
Parringstype
For studien kreves tester (referanse) stammer med kjente parringstyper - A1 og A2. Testisolatet blir inokulert med dem parvis i petriskåler med havreagarmedium. Etter inkubering i 10 dager undersøkes platene for tilstedeværelse eller fravær av oosporer i mediet i kontaktsonen til stammene. Det er fire alternativer: stammen tilhører A4-parringstypen, hvis den danner oosporer med A1-testeren, til A2, hvis den danner oosporer med A2-testeren, til A1A1, hvis den danner oosporer med begge testere, eller er steril (2), hvis den ikke danner oosporer uten testere (de to siste gruppene er sjeldne).
For raskere å bestemme hvilke typer parring, ble det gjort forsøk på å identifisere regioner i genomet assosiert med typen parring, med sikte på videre bruk for å bestemme typen parring ved PCR. Et av de første vellykkede eksperimentene for å identifisere et slikt sted ble utført av amerikanske forskere (Judelson et al., 1995). Ved hjelp av RAPD-metoden klarte de å identifisere W16-regionen assosiert med parringstypen i avkommet til to kryssede isolater, og designe et par 24-bp primere for dens forsterkning (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') og W16-2 (5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Etter restriksjon av PCR-produktet med restriksjonsenzymet HaeIII var det mulig å skille isolater med parringstypene A1 og A2.
Et annet forsøk på å skaffe PCR-markører for å bestemme hvilke typer parring ble utført av koreanske forskere (Kim, Lee, 2002). De identifiserte spesifikke produkter ved hjelp av AFLP-metoden. Som et resultat ble et par primere PHYB-1 (forover) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') og PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3') utviklet, slik at selektiv forsterkning av genomregionen assosiert med A2-parring. Deretter fortsatte de dette arbeidet og designet primere 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, fremover) og 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), slik at selektiv forsterkning av Mat-A1-regionen karakteristisk for stammer med parringstype A1. Bruk av PCR-diagnostikk av parringstyper viste gode resultater i studien av P. infestans-populasjoner i Tsjekkia (Mazakova et al., 2006), Tunisia (Jmour, Hamada, 2006) og andre regioner. I vårt laboratorium (Mytsa, Elansky, upublisert) ble 34 P. infestans stammer isolert fra syke potet- og tomatorganer i forskjellige regioner i Russland (Kostroma, Ryazan, Astrakhan, Moskva oblaster) analysert. Resultatene av PCR-analyse ved bruk av spesifikke primere mer enn 90% falt sammen med resultatene av analysen av parringstypen etter den tradisjonelle metoden på et næringsmedium.
Tabell 1. Variasjon av motstand i Sib 1-klonen (Elansky et al., 2001)
Eksempel på henteplass | Antall isolater analysert | Antall følsomme (S), svakt motstandsdyktige (SR) og motstandsdyktige (R) stammer, stk (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnoyarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Jekaterinburg by | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sakhalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Omsk-regionen | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Metalaksylmotstand som populasjonsmarkør
På begynnelsen av 1980-tallet ble det observert kraftige utbrudd av sen rødme forårsaket av metallaksylresistente P. infestans-stammer i forskjellige regioner. Potetbruk i mange land har hatt betydelige tap (Dowley & O'Sullivan, 1981; Davidse et al., 1983; Derevyagina, 1991). Siden da har det i mange land i verden blitt gjennomført konstant overvåking av forekomst av fenylamidresistente stammer i P. infestans-populasjoner. I tillegg til en praktisk vurdering av utsiktene for bruk av fenylamidholdige medikamenter, bygging av et system med beskyttende tiltak og forutsigelse av epytytotika, har motstand mot disse legemidlene blitt en av markørfunksjonene som er mye brukt for komparativ analyse av populasjoner av dette patogenet. Bruk av resistens mot metalaxyl i sammenlignende populasjonsstudier bør imidlertid utføres med tanke på at: 1 - det genetiske grunnlaget for resistens ennå ikke er bestemt nøyaktig, 2 - resistens mot metalaxyl er et selektivt avhengig trekk som kan variere avhengig av bruk av fenylamider, 3 - forskjellige graden av følsomhet for metalaxyl-stammer innenfor en klonal linje (tabell 1).
Spekter av isozymer
Isozymmarkører er vanligvis uavhengige av ytre forhold, viser mendelsk arv og er kodominante, slik at man kan skille mellom homo- og heterozygoter. Bruken av proteiner som genmarkører gjør det mulig å identifisere både store omorganiseringer av det genetiske materialet, inkludert kromosomale og genomiske mutasjoner, og enkelt aminosyresubstitusjoner.
Elektroforetiske studier av proteiner har vist at de fleste enzymer eksisterer i organismer i form av flere fraksjoner som avviker i elektroforetisk mobilitet. Disse fraksjonene er resultatet av koding av flere former for enzymer av forskjellige lokus (isozymer eller isozymer) eller av forskjellige alleler av samme lokus (allozymer eller alloenzymer). Det vil si at isozymer er forskjellige former for ett enzym. Ulike former har den samme katalytiske aktiviteten, men avviker litt i enkelte aminosyresubstitusjoner i peptidet og har ansvaret. Slike forskjeller blir avslørt under elektroforese.
I studien av P. infestans-stammer brukes spektrene av isoenzymer av to proteiner, peptidase og glukose-6-fosfatisomerase, (dette enzymet er monomorf i russiske populasjoner, derfor blir ikke metodene for studien presentert i dette arbeidet). For å skille dem inn i isozymer i et elektrisk felt, påføres proteinpreparater isolert fra de studerte organismer på en gelplate plassert i et elektrisk felt. Diffusjonshastigheten til individuelle proteiner i gelen avhenger av ladningen og molekylvekten. Derfor, i et elektrisk felt, skilles blandingen av proteiner i individuelle fraksjoner, som kan visualiseres ved hjelp av spesielle fargestoffer.
Studien av peptidase-isoenzymer utføres på celluloseacetat-, stivelses- eller polyakrylamidgeler. Den mest praktiske er metoden basert på bruken av celluloseacetatgeler produsert av Helena Laboratories Inc. Det krever ikke store mengder testmaterialer, det tillater en å oppnå kontrasterende bånd på gelen etter elektroforese for begge enzymlokiene, implementeringen krever ikke store tids- og materialkostnader (figur 2).
Et lite stykke mycelium overføres til en 1,5 ml mikrorør, det tilsettes 1-2 dråper destillert vann. Etter det homogeniseres prøven (for eksempel med en elektrisk boremaskin med et plastfeste som er egnet for en mikrorør) og sedimenteres i 25 sekunder på en sentrifuge ved 13000 o / min. 8 ul fra hver mikrorør. supernatanten overføres til applikatorplaten.
Celluloseacetatgelen fjernes fra bufferbeholderen, blottes mellom to ark filterpapir og plasseres med arbeidslaget opp på applikatorens plastbunn. Løsningen fra platen overføres av applikatoren til gelen 2-4 ganger. Gelen overføres til et elektroforesekammer,
Tabell 2. Sammensetningen av løsningen som brukes til farging av celluloseacetatgel i analysen av peptidase-isoenzymer, en dråpe maling (bromfenolblå) plasseres på kanten av gelen.
TRIS HCl, 0,05 M, Ph 8,0 2 ml
Peroksidase, 1000 U / ml 5 dråper
o-dianisidin, 4 mg / ml 8 dråper
MgCl2, 20 mg / ml 2 dråper
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 dråper
L-aminosyreoksidase, 20 u / ml 2 dråper
Elektroforese utføres i 20 minutter. ved 200 V. Etter elektroforese overføres gelen til et malebord og farges med en spesiell malingsløsning (tabell 2). 10 ml 1,6% DIFCO-agar smelter foreløpig i en mikrobølgeovn, avkjøles til 60 ° C, hvorpå 2 ml agar blandes med en malingsblanding og helles på en gel. Striper vises innen 15-20 minutter. L-aminosyre-oksidasereagenset tilsettes umiddelbart før blandingen av løsningen med smeltet agar.
I russiske populasjoner er Pep 1-locus representert med genotyper 100/100 og 92/100. Homozygote 92/92 er ekstremt sjelden (ca. 0,1%). Locus Pehr 2 er representert av tre genotyper 100/100, 100/112 og 112/112, og alle de 3 variantene er ganske vanlige (Elanky og Smirnov, 2003, fig. 2).
Genomforskning
Begrensningsfragmentlengde polymorfisme med påfølgende hybridisering (RFLP-RG 57)
Det totale DNA behandles med Eco R1-restriksjonsenzym, DNA-fragmentene skilles fra ved elektroforese i agarosegel. Nukleært DNA er veldig stort og har mange repeterende sekvenser, noe som gjør det vanskelig å direkte analysere de mange fragmentene som oppnås ved virkningen av restriksjonsenzymer. Derfor blir DNA-fragmentene separert i gelen overført til en spesiell membran og brukt til hybridisering med RG 57-sonden, som inkluderer nukleotider merket med radioaktive eller fluorescerende markører. Denne sonden hybridiserer med repeterende genomiske sekvenser (Goodwin et al., 1992, Forbes et al., 1998). Etter visualisering av resultatene av hybridisering på et lys- eller radioaktivt materiale, oppnås en multi-locus hybridiseringsprofil (fingeravtrykk), representert med 25-29 fragmenter (Forbes et al., 1998). Aseksuelle (klonale) avkom vil ha de samme profilene. Ved å arrangere båndene på elektroforetogrammet kan man bedømme likhetene og forskjellene til de sammenlignede organismer.
Mitokondrie DNA-haplotyper
I de fleste eukaryote celler presenteres mtDNA i form av et dobbeltstrenget sirkulært DNA-molekyl, som i motsetning til kjernekromosomene i eukaryote celler replikerer semi-konservativt og ikke er assosiert med proteinmolekyler.
Det mitokondrielle genomet til P. infestans ble sekvensert, og en rekke arbeider ble viet til analysen av restriksjonsfragmentlengder (Carter et al, 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Etter at Griffith og Shaw (1998) utviklet en enkel og rask metode for å bestemme mtDNA-haplotyper, ble denne markøren en av de mest populære i P. Infestans-studier. Essensen av metoden består i sekvensiell forsterkning av to mitokondrielle DNA-fragmenter (fra det felles genomet) med primere F2-R2 og F4-R4 (tabell 3) og deres påfølgende restriksjon med restriksjonsenzymer MspI (1. fragment) og EcoR1 (2. fragment). Metoden lar deg identifisere 4 haplotyper: Ia, IIa, Ib, IIb. Type II skiller seg fra type I ved tilstedeværelsen av en innsats 1881 bp i størrelse og ved en annen plassering av restriksjonssteder i regionene P2 og P4 (fig. 3).
Siden 1996 ble bare haplotypene Ia og IIa notert blant stammene samlet på Russlands territorium (Elansky et al., 2001, 2015). De kan identifiseres etter separasjon av restriksjonsproduktene med F2-R2-primeren i et elektrisk felt (fig. 4, 5). Typer mtDNA brukes i komparativ analyse av stammer og populasjoner. I en rekke studier ble typer mitokondrie-DNA brukt til å isolere klonlinjer og passere P. infestans-isolater (Botez et al., 2007; Shein et al., 2009). Ved hjelp av PCR-RFLP-metoden ble det konkludert med at mtDNA er heterogent i samme P. infestans-stamme (Elansky og Milyutina, 2007). Forsterkningsbetingelser: 1x (500 sek. 94 ° C), 40 x (30 sek. 90 ° C, 30 sek. 52 ° C, 90 sek. 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Reaksjonsblanding: (20 ul): 0,2 U Taq DNA-polymerase, 1 x 2,5 mM MgCl2-Taq-buffer, 0,2 mM hver dNTP, 30 pM primer og 5 ng av det analyserte DNA, avionisert vann - opp til 20 ul.
Begrensning av PCR-produktet utføres i 4-6 timer ved en temperatur på 37 ° C. Restriksjonsblanding (20 ul): 10 x MspI (2 ul), 10 ganger restriksjonsbuffer (2 ul), avionisert vann (6 ul), PCR-produkt (10 ul).
Tabell 3. Primere brukt for amplifikasjon av mtDNA polymorfe regioner
Locus | primer | Grunning lengde og plassering | PCR-produktlengde | Begrens |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
Random primer amplification (RAPD)
Når du utfører RAPD, brukes en primer (noen ganger flere primere samtidig) med en vilkårlig nukleotidsekvens, vanligvis 10 nukleotider i lengde, med høyt innhold (fra 50%) GC-nukleotider og lav glødetemperatur (ca. 35 ° C). Slike primere "lander" på mange komplementære steder i genomet. Etter forsterkning oppnås et stort antall amplikoner. Antallet deres avhenger av primeren (ene) som brukes og reaksjonsbetingelsene (MgCl2-konsentrasjon og glødetemperatur).
Visualisering av amplikoner utføres ved destillasjon i polyakrylamid eller agarosegel. Når du utfører RAPD-analyse, er det nødvendig å nøye overvåke renheten til det analyserte materialet, fordi forurensning med andre levende gjenstander kan forårsake en betydelig økning i antall gjenstander, som er ganske mange i analysen av rent materiale (Perez et al, 1998). Bruken av denne metoden i studiet av P. infestans genomet gjenspeiles i mange verk (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire et al., 2002, Carlisle et al., 2001). Valget av reaksjonsbetingelser og primere (51 10-nukleotidprimere ble studert) er gitt i artikkelen av Abu-El Samen et al., (2003).
Microsatellite Repeat Analysis (SSR)
Mikrosatellitt-gjentakelser (enkle sekvensgjentakelser, SSR) er gjentatte korte sekvenser med 1-3 (noen ganger opptil 6) nukleotider til stede i kjernegenomene til alle eukaryoter. Antallet påfølgende gjentakelser kan variere fra 10 til 100. Microsatellite loci forekommer med ganske høy frekvens og er mer eller mindre jevnt fordelt i hele genomet (Lagercrantz et al., 1993). Polymorfisme av mikrosatellitt-sekvenser er assosiert med forskjeller i antall gjentakelser av grunnmotivet. Mikrosatellittmarkører er kodominante, noe som gjør det mulig å bruke dem til å analysere strukturen i en populasjon, bestemme slektskap, migrasjonsveier for genotyper, etc. Blant andre fordeler med disse markørene, bør man være oppmerksom på deres høye polymorfisme, god reproduserbarhet, nøytralitet og evnen til å utføre automatisk analyse og evaluering Analyse av polymorfisme av mikrosatellittgjentakelser utføres ved PCR-forsterkning ved bruk av primere som er komplementære til unike sekvenser som flankerer mikrosatellitt loci Opprinnelig ble analysen utført med separasjon av reaksjonsproduktene på en polyakrylamidgel. Senere foreslo de ansatte i selskapet Applied Biosystems å bruke fluorescerende merkede primere til påvisning av reaksjonsprodukter ved hjelp av en automatisk laserdetektor (Diehl et al., 1990), og deretter standard automatiske DNA-sekvenserere (Ziegle et al., 1992). Merking av primere med forskjellige fluorescerende fargestoffer lar deg analysere flere markører samtidig på en fil og dermed øke produktiviteten til metoden betydelig og øke nøyaktigheten av analysen.
De første publikasjonene viet til bruk av SSR-analyse for studien av P. infestans dukket opp på begynnelsen av 2000-tallet. (Knapova, Gisi, 2002). Ikke alle markørene foreslått av forfatterne viste en tilstrekkelig grad av polymorfisme, men to av dem (4B og G11) ble inkludert i settet med 12 SSR-markører foreslått av Lees et al. (2006) og ble deretter vedtatt av Eucablight-forskningsnettverket (www.eucablight .org) som standard for P. infestans. Noen år senere ble det publisert en studie om opprettelsen av et system for multipleksanalyse av P. infestans DNA basert på åtte SSR-markører (Li et al., 2010). Til slutt, etter å ha evaluert alle tidligere foreslåtte markører og valgt den mest informative av dem, i tillegg til å optimalisere primere, fluorescerende etiketter og forsterkningsbetingelser, presenterte den samme gruppen av forfattere et system for en-trinns multipleksanalyse, inkludert 12 markører (tabell 4; Li et al. , 2013a). Primerne som ble brukt i dette systemet ble valgt og merket med en av fire fluorescerende markører (FAM, VIC, NED, PET) slik at områdene for allelstørrelser av primere med de samme merkene ikke overlappet.
Forfatterne utførte analysen på en PTC200 forsterker (MJ Research, USA) ved bruk av QIAGEN multiplex PCR-sett eller QIAGEN Typeit Microsatellite PCR-sett. Volumet av reaksjonsblandingen var 12.5 μL. Amplifikasjonsbetingelsene var som følger: for QIAGEN multiplex PCR: 95 ° C (15 min), 30x (95 ° C (20 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (60 s), 72 ° C (20 min); for QIAGEN Type-it Microsatellite PCR: 95 ° C (5 min), 28x (95 ° C (30 sek), 58 ° C (90 sek), 72 ° C (20 sek), 60 ° C (30 min).
Separasjon og visualisering av PCR-produkter ble utført ved bruk av en ABI3730 automatisk kapillær DNA-analysator (Applied Biosystems).
Tabell 4. Kjennetegn på 12 standard SSR-markører brukt til genotyping av P. Infestans (Li et al., 2013a)
Navn | Antall alleler | Størrelsesområde alleler (bp) | Grunning |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
PI02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | F: FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTACAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | F: FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACAACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | FAM-TCTTGTTCGAGTATGGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
PI04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
PI70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
PI63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Et eksempel på visualisering av analyseresultatene er vist i fig. 6. Resultatene ble analysert ved bruk av GeneMapper 3.7-programvare ved å sammenligne de innhentede dataene med dataene fra kjente isolater. For å forenkle tolkningen av analyseresultatene, er det nødvendig å inkludere 1-2 referanseisolater med en kjent genotype i hver studie.
Den foreslåtte forskningsmetoden ble testet på et betydelig antall feltprøver, hvoretter forfatterne standardiserte protokoller mellom laboratorier fra to organisasjoner, The James Hutton Institute (UK) og Wageningen University & Research (Nederland), som sammen med muligheten for å bruke standard FTA-kort for forenklet innsamling og forsendelse av P. infestans DNA-prøver gjorde det mulig å snakke om muligheten for kommersiell bruk av denne utviklingen. I tillegg gjorde en rask og nøyaktig metode for genotyping av P. infestans-isolater ved hjelp av multiplex SSR-analyse det mulig å gjennomføre standardiserte studier av populasjoner av dette patogenet på global skala, og opprettelse av en verdensdatabase på sen kviste innenfor rammen av Eucablight-prosjektet (www.eucablight.org), inkludert , inkludert resultatene av mikrosatellittanalyse, gjorde det mulig å spore fremveksten og spredningen av nye genotyper over hele verden.
Amplifisert begrensningsfragmentlengde polymorfisme (AFLP). AFLP (amplified fragment length polymorphism) er en teknologi for å generere tilfeldige molekylære markører ved bruk av spesifikke primere. I AFLP behandles DNA med en kombinasjon av to restriksjonsenzymer. Spesifikke adaptere ligeres til de klebrig ender av restriksjonsfragmentene.
Disse fragmentene amplifiseres deretter ved å bruke primere som er komplementære til adapter-sekvensen og restriksjonssettet og i tillegg bærer en eller flere tilfeldige baser i deres 3'-ender. Settet med oppnådde fragmenter avhenger av restriksjonsenzymer og tilfeldig utvalgte nukleotider ved 3'-endene av primerne (Vos et al., 1995). AFLP - genotyping brukes til å raskt studere den genetiske variasjonen av forskjellige organismer.
En detaljert beskrivelse av metoden er gitt i verk av Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul et al., 1999. Mye arbeid med å sammenligne oppløsningen av AFLP og SSR-metoder er utført av kinesiske forskere. De fenotypiske og genotypiske egenskapene til 48 P. infestans isolater samlet i fem regioner i Nord-Kina ble studert. AFLP-spektrene avslørte åtte forskjellige DNA-genotyper, i motsetning til SSR-genotyper, som det ikke ble funnet noe mangfold for (Guo et al., 2008).
Forsterkning med primere som er homologe med sekvensene av mobile elementer
Markører avledet fra sekvenser av retrotransposoner er veldig praktiske for genetisk kartlegging, studiet av genetisk mangfold og evolusjonære prosesser (Schulman, 2006). Hvis det lages primere som er komplementære til de stabile sekvensene til visse mobile elementer, er det mulig å forsterke regionene i genomet som ligger mellom dem. I studier av det forårsakende middel til sen rødme ble metoden for å amplifisere deler av genomet ved hjelp av en primer som er komplementær til kjernesekvensen til SINE (Short Interspersed Nuclear Elements) retropazon, brukt med hell (Lavrova og Elansky, 2003). Ved å bruke denne metoden ble forskjeller avslørt selv i aseksuell avkom av ett isolat. I denne forbindelse ble det konkludert med at inter-SINE-PCR-metoden er svært spesifikk og bevegelsesgraden for SINE-elementer i Phytophthora-genomet er høy.
I genomet til P. infestans har 12 familier med korte retrotransposoner (SINE) blitt identifisert; artsdistribusjonen av korte retrotransposoner ble undersøkt, det ble identifisert elementer (SINE) som er funnet i genomet til bare P. infestans (Lavrova, 2004).
Funksjoner ved anvendelse av metoder for komparativ studie av stammer i populasjonsstudier
Når du planlegger en studie, er det nødvendig å tydelig forstå målene den forfølger og bruke de riktige metodene. Dermed tillater noen metoder å generere et stort antall uavhengige markørtegn, men samtidig har de lav reproduserbarhet og er sterkt avhengig av reagensene som brukes, reaksjonsbetingelser og forurensning av materialet som studeres. Derfor, i hver studie av en gruppe stammer, er det nødvendig å bruke flere standard (referanse) isolater, men selv i dette tilfellet er resultatene av flere eksperimenter veldig vanskelige å kombinere.
Denne gruppen av metoder inkluderer RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Etter amplifisering oppnås et stort antall DNA-fragmenter av forskjellige størrelser. Det anbefales å bruke slike teknikker når det er nødvendig å etablere forskjeller mellom nært beslektede stammer (foreldre-avkom, villtypemutanter osv.), Eller i tilfeller der det kreves en detaljert analyse av et lite utvalg. Dermed blir AFLP-metoden mye brukt i genetisk kartlegging av P. infestans (van der Lee et al., 1997) og i intrapopulasjonsstudier (Knapova, Gisi, 2002, Cooke et al, 2003, Flier et al, 2003). Slike metoder er upraktiske å bruke når man lager databaser over stammer, siden det er praktisk talt umulig å samle regnskapsføringen av resultatene når man gjennomfører analyser i forskjellige laboratorier.
Til tross for den tilsynelatende enkelheten og hastigheten på utførelsen (DNA-isolasjon uten god rensing, forsterkning, visualisering av resultatene), krever denne gruppen av metoder bruk av en spesiell metode for å dokumentere resultatene: destillasjon i polyakrylamidgel med merkede (radioaktive eller selvlysende) primere og påfølgende belysning av lys eller radioaktivt materiale. Konvensjonell etidiumbromidagarosegelavbildning er generelt ikke egnet for disse metodene fordi et stort antall DNA-fragmenter i forskjellige størrelser kan smelte sammen.
Andre metoder, tvert imot, lar deg generere et lite antall funksjoner med veldig høy reproduserbarhet. Denne gruppen inkluderer studiet av mitokondrie DNA-haplotyper (bare to haplotyper Ia og IIa er notert i Russland), parringstype (de fleste isolater er delt inn i to typer: A2 og A1, selvfruktbar SF er sjelden funnet) og peptidasase-enzymspektre (to loci Pep2 og Pep1 , bestående av to isozymer hver) og glukose-2-fosfatisomerase (i Russland er det ingen variabilitet for dette trekk, selv om signifikant polymorfisme er notert i andre land i verden). Det anbefales at du bruker disse funksjonene når du analyserer samlinger, sammenstiller regionale og globale databaser. Når det gjelder analysen av isozymer og haplotyper av mitokondrie-DNA, er det mulig å gjøre uten standardstammer i det hele tatt, mens det i analysen av parringstyper kreves to testisolater med kjente parringstyper.
Reaksjonsbetingelsene og reagensene kan bare påvirke produktets kontrast på elektroforetogrammet; manifestasjonen av gjenstander i denne typen studier er usannsynlig.
For tiden er de fleste populasjoner i den europeiske delen av Russland representert av stammer av begge typer parring (tabell 6), blant dem er det isolater med typene Ia og IIa av mitokondrie-DNA (andre typer mtDNA funnet i verden har ikke blitt funnet i Russland etter 1993). Spektrene til peptidasase-enzymer er representert av to genotyper på Pep1-locus (100/100, 92/92 og heterozygote 92/100, og 92/92 genotypen er ekstremt sjelden (<0,3%)) og av to genotyper på Pep 2-locus (100/100 , 112/112 og heterozygote 100/112, med genotypen 112/112 som forekommer sjeldnere enn 100/100, men også ganske ofte).
Det var ingen variasjon i spekteret av isozymer av glukose-6-fosfatisomerase etter 1993 (forsvinningen av klonlinjen US-1); alle studerte isolater hadde 100/100-genotypen (Elansky og Smirnov, 2002).
Den tredje gruppen av metoder gjør det mulig å oppnå en tilstrekkelig gruppe uavhengige markørfunksjoner med høy reproduserbarhet. I dag inkluderer denne gruppen RFLP-RG57-sonden, som produserer 25-29 DNA-fragmenter av forskjellige størrelser. RFLP-RG57 kan brukes både når man analyserer prøver og kompilerer databaser. Imidlertid er denne metoden mye dyrere enn de forrige, den er tidkrevende og krever en tilstrekkelig stor mengde høyt renset DNA. Derfor blir forskeren tvunget til å begrense volumet av det testede materialet.
Utviklingen av RFLP-RG57 på begynnelsen av 90-tallet i forrige århundre intensiverte populasjonsstudier av det forårsakende middel til sen rødme. Det ble grunnlaget for metoden basert på valg og analyse av "Klonale linjer" (se nedenfor). Sammen med RFLP-RG57 brukes parringstype, DNA-fingeravtrykk (RFLP-RG57-metoden), spektre av peptidase og glukose-6-fosfatisomerase-isoenzymer og mitokondriell DNA-type for å identifisere klonale linjer. Takket være ham ble det vist al., 1994), erstatning av gamle populasjoner med nye (Drenth et al, 1993, Sujkowski et al, 1994, Goodwin et al, 1995a), avslørte klonale linjer som hersker i mange land i verden. Studier av russiske stammer ved bruk av denne metoden viste en høy genotypisk polymorfisme av stammene av den europeiske delen og monomorfisme av befolkningene i de asiatiske og fjernøstlige delene av Russland (Elansky et al, 2001). Og nå er denne metoden fortsatt den viktigste i populasjonsstudier av P. infestans. Imidlertid er den brede fordelingen hindret av dens ganske høye kostnader og arbeidsintensitet i utførelsen.
En annen lovende teknikk som sjelden brukes i P. infestans-studier er microsatellite repeat (SSR) analyse. For tiden er denne metoden mye brukt for å isolere klonlinjer. For analyse av stammer ble slike fenotypiske markørtrekk som tilstedeværelsen av virulensgener til potetvarianter (Avdey, 1995, Ivanyuk et al., 2002, Ulanova et al., 2003) og tomat mye brukt (og blir fortsatt brukt). Nå har gener for virulens mot potetvarianter mistet verdien som markørtrekk for populasjonsstudier på grunn av utseendet til det maksimale (eller nær det) antall virulensgener i de aller fleste isolater. Samtidig blir T1-virulensgenet for tomatkulturer som bærer det tilsvarende Ph1-genet fremdeles vellykket brukt som markøregenskap (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al., 2003).
I mange arbeider brukes motstand mot soppdrepende midler som markørtrekk. Denne egenskapen er uønsket å bruke i populasjonsstudier på grunn av det ganske enkle utseendet på resistensmutasjoner i klonale linjer etter påføring av metalaxyl- (eller mefenoxam-) inneholdende soppdrepende midler i feltet. For eksempel ble signifikante forskjeller i motstandsnivå vist innenfor Sib1-klonlinjen (Elansky et al., 2001).
Således er parringstype, peptidasase-enzymspektrum, mitokondriell DNA-type, RFLP-RG57, SSR foretrukne markører for å lage databanker og merke stammer i samlinger. For å sammenligne begrensede prøver, hvis det er nødvendig å bruke maksimalt antall markørfunksjoner, kan du bruke AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (tabell 5). Det skal imidlertid huskes at disse metodene er lite reproduserbare, og i hvert enkelt eksperiment (amplifikasjonselektroforesesyklus) er det nødvendig å bruke flere referanseisolater.
Tabell 5. Sammenligning av forskjellige metoder for forskning på stammer P. infestans
kriterium | TC | Isofer-politiet | MtDNA | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | Rev |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Mengde informasjon | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Reproduserbarhet | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Mulighet for gjenstander | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Koste | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Arbeidsintensitet | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Analysehastighet ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Merk: H - lav, C - medium, B - høy; НС * - arbeidsintensiteten er lav når du bruker agarosegel eller automatisk
genotyper, medium - ved destillasjon i polyakrylamidgel med merkede primere,
** - ikke medregnet tiden brukt på å dyrke mycelium for DNA-isolasjon.
Befolkningsstruktur
Klonale linjer
I fravær av rekombinasjon eller dets ubetydelige bidrag til befolkningsstrukturen, består befolkningen av et visst antall kloner, hvor genetisk utveksling er ekstremt sjelden.
I slike populasjoner er det mer informativt å studere ikke frekvensene til individuelle gener, men frekvensene til genotyper som har en felles opprinnelse (klonlinjer eller klonlinjer) og som bare avviker i punktmutasjoner. Befolkningsstudier av senblodspatogenet og analysen av klonlinjer har betydelig akselerert siden adventen av RFLP-RG57-metoden tidlig på 90-tallet i forrige århundre. Sammen med RFLP-RG57 brukes parringstype, spektra av peptidase og glukose-6-fosfatisomerase-isoenzymer og mitokondriell DNA-type for å identifisere klonale linjer. Egenskapene til de vanligste klonlinjene er vist i tabell 6.
Klon US-1 dominerte befolkningene overalt til slutten av 80-tallet, hvorpå den begynte å bli erstattet av andre kloner og forsvant fra Europa og Nord-Amerika. Det finnes nå i Fjernøsten (Filippinene, Taiwan, Kina, Japan, Korea, Koh et al., 1994, Mosa et al., 1993), i Afrika (Uganda, Kenya, Rwanda, Goodwin et al., 1994, Vega-Sanchez et. al., 2000; Ochwo et al., 2002) og i Sør-Amerika (Ecuador, Brasil, Peru, Forbes et al., 1997, Goodwin et al., 1994). Ingen stammer som tilhører US-1-linjen er identifisert i Australia alene. Tilsynelatende kom P. infestans isolater til Australia med en ny migrasjonsbølge (Goodwin, 1997).
Klon US-6 migrerte fra Nord-Mexico til California på slutten av 70-tallet og forårsaket en epidemi der i poteter og tomater etter 32 år uten sykdom. På grunn av sin høye aggressivitet fortrengte den USA-1-klonen og begynte å dominere på vestkysten av USA (Goodwin et al., 1995a).
Genotypene US-7 og US-8 ble oppdaget i USA i 1992, og allerede i 1994 ble de distribuert mye i USA og Canada. I løpet av en feltsesong er klon US-8 i stand til nesten helt å fortrenge klon US-1 i potetplotter som opprinnelig ble infisert med begge kloner i like konsentrasjon (Miller og Johnson, 2000).
Kloner BC-1 til BC-4 er identifisert i British Columbia i et lite antall isolater fra Goodwin et al., 1995b). Klon US-11 spredte seg vidt i USA og fortrengte US-1 i Taiwan. Klonene JP-1 og EC-1, sammen med klon US-1, er vanlige i henholdsvis Japan og Ecuador (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 er en klon som hersket i Russland over et enormt territorium fra Moskva-regionen til Sakhalin. I Moskva-regionen ble den oppdaget i 1993, og noen feltpopulasjoner besto hovedsakelig av stammer av denne klonlinjen, svært motstandsdyktige mot metalaxyl. Etter 1993 reduserte forekomsten av denne klonen betydelig. Utenfor Ural i 1997-1998 ble SIB-1 funnet overalt, med unntak av Khabarovsk-territoriet (klonen SIB-2 er utbredt der). Den romlige separasjonen av kloner med forskjellige typer parring ekskluderer den seksuelle prosessen i Sibir og Fjernøsten. I Moskva-regionen, i motsetning til Sibir, er befolkningen representert av mange kloner; nesten hvert isolat har en unik multilokusgenotype (Elansky et al., 2001, 2015). Dette mangfoldet kan ikke bare forklares med import av soppstammer fra forskjellige deler av verden med importert frømateriale. Siden begge typer parring forekommer i befolkningen, er det mulig at mangfoldet også skyldes rekombinasjon. I British Columbia antas således fremveksten av genotyper BC-2, BC-3 og BC-4 på grunn av hybridisering av kloner BC-1 og US-6 (Goodwin et al., 1995b). Det er mulig at hybridstammer finnes i befolkningen i Moskva. For eksempel kan stammer MO-4, MO-8 og MO-11 heterozygote for PEP-locus være hybrider mellom stammer MO-12, MO-21, MO-22, med A2-parringstype og homozygot for en allel av PEP-locus og stammen MO-8, med paringstypen A1 og homozygot for en annen allel av locus. Og hvis dette er tilfelle, og i moderne populasjoner av P. infestans er det en tendens til en økning i den seksuelle prosessens rolle, vil informasjonsverdien av analysen av multilokuskloner reduseres (Elansky et al., 2001, 2015).
Variasjon i klonale linjer
Fram til 90-tallet av 20-tallet var den klonale linjen US-1 utbredt i verden. Det meste av felt- og regionalpopulasjonen besto utelukkende av stammer med US-1-genotypen. Imidlertid ble det også observert forskjeller mellom isolater, mest sannsynlig forårsaket av en mutasjonsprosess. Mutasjoner skjedde i både nukleært og mitokondrie-DNA og påvirket blant annet resistensnivået mot fenylamidmedikamenter og antall virulensgener. Linjer som skiller seg fra de opprinnelige genotypene ved mutasjoner, er angitt med tilleggstall etter punktet som følger navnet på den opprinnelige genotypen (for eksempel US-1.1-mutantlinjen til klonlinjen US-1). Fingeravtrykk-DNA-linjer US-1.5 og US-1.6 inneholder tilbehørslinjer av forskjellige størrelser (Goodwin et al., 1995a, 1995b); klonlinjen US-6.3 skiller seg også fra US-6 i en tilbehørslinje (Goodwin, 1997, tabell 7).
I studien av mitokondrie-DNA ble det funnet at bare type 1b mitokondrie-DNA finnes i klonlinjen US-1 (Carter et al., 1990). Imidlertid ble det i studien av stammer av denne klonavstamningen fra Peru og Filippinene funnet isolater hvis mitokondrielle DNA-typer skilte seg fra 1b i nærvær av innsettinger og slettinger (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994).
Tabell 6. Multilokus-genotyper av noen P. infestans klonlinjer
Navn | Parringstype | Isozymer | DNA fingeravtrykk | MtDNA-type | |
GPI | PEP | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011E + 24 | Ib |
US-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011E + 24 | - |
US-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011E + 24 | IIb |
US-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
US-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
US-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIb |
US-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | - |
US-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011E + 24 | - |
US-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011E + 24 | - |
US-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011E + 24 | - |
US-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
EF-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011E + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011E + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011E + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011E + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011E + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011E + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011E + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011E + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011E + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011E + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011E + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
Merk: * - ingen data.
Tabell 7. Multilokus-genotyper og deres mutante linjer
Navn | Parringstype | | DNA-fingeravtrykk (RG57) | Merknader | |
GPI | PEP-1 | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Opprinnelig genotype 1 |
US-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutasjon i PEP |
US-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutasjon i RG57 |
US-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutasjon i RG57 |
US-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutasjon i RG57 og PEP |
US-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutasjon i RG57 |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Opprinnelig genotype 2 |
US-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutasjon i PEP |
US-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutasjon i RG57 |
US-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutasjon i RG57 |
US-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutasjon i RG57 og PEP |
US-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutasjon i RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Opprinnelig genotype 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutasjon i RG57 |
Det er også endringer i spektrene til isozymer. Som regel er de forårsaket av nedbrytningen av en organisme som i utgangspunktet heterozygot for dette enzymet til homozygote. I 1993 identifiserte vi på tomatfrukter en stamme med karakteristikker som er karakteristiske for US-1: RG57 fingeravtrykk, mitokondrie DNA-type og 86/100 genotype for glukose-6-fosfat-isomerase, men det var homozygot (100/100) for det første peptidase-stedet i stedet for en 92/100 heterozygote typisk for denne klonlinjen. Vi kalte genotypen til denne stammen MO-17 (tabell 6). Mutantlinjene US-1.1 og US-1.4 skiller seg også fra US-1 ved mutasjoner på det første peptidasestedet (tabell 7).
Mutasjoner som fører til endringer i antall virulensgener for potet- og tomatvarianter er ganske vanlige. De ble notert blant isolater av klonlinjen US-1 i populasjoner fra Nederland (Drenth et al., 1994), Peru (Goodwin et al., 1995a), Polen (Sujkowski et al., 1991), Nord-Nord-Amerika (Goodwin et al., ., 1995b). Forskjeller i antall potetvirulensgener ble også notert blant isolater av klonlinjene US-7 og US-8 i Canada og USA (Goodwin et al., 1995a), blant isolater av SIB-1-linjen i den asiatiske delen av Russland (Elansky et al, 2001 ).
Isolater med sterke forskjeller i resistensnivåer mot fenylamidmedisiner ble identifisert i monoklonale feltpopulasjoner, som alle tilhørte klonlinjen Sib-1 (Elansky et al, 2001, tabell 1). Nesten alle stammer av den klonale linjen US-1 er svært utsatt for metalaksyl, men svært motstandsdyktige isolater av denne linjen ble isolert i Filippinene (Koh et al., 1994) og i Irland (Goodwin et al., 1996).
Moderne populasjoner av P. infestans
Mellom-Amerika (Mexico)
P. infestans-befolkningen i Mexico skiller seg markant fra andre verdenspopulasjoner, noe som hovedsakelig skyldes sin historiske posisjon. Tallrike studier av denne populasjonen og beslektede arter av P. infestans av kladen Phytophthora, så vel som lokale arter av slekten Solanum, førte til konklusjonen at utviklingen av patogenet i den sentrale delen av Mexico skjedde sammen med utviklingen av vertsplanter og var assosiert med seksuell rekombinasjon (Grünwald, Flier , 2005). Begge parringene er representert i populasjonen, og i like store proporsjoner, og tilstedeværelsen av oosporer i jorden på planter og knoller av poteter og villrelaterte Solanum-arter bekrefter tilstedeværelsen av en seksuell prosess i befolkningen (Fernández-Pavía et al., 2002). Nylige studier av Toluca-dalen og dens omegn (det antagelige opprinnelsessenteret til patogenet) bekreftet det høye genetiske mangfoldet til den lokale befolkningen av P. infestans (134 multilokus-genotyper i et utvalg på 176 prøver) og tilstedeværelsen av flere differensierte delpopulasjoner i regionen (Wang et al., 2017). Faktorer som bidrar til denne differensieringen er den romlige inndelingen av delpopulasjoner som er karakteristiske for høylandet i det sentrale Mexico, forskjeller i dyrkingsforhold og potetvarianter brukt i daler og fjell, og tilstedeværelsen av ville tuberøse Solanum-arter som kan fungere som alternative verter (Fry et al. ., 2009).
Det skal imidlertid bemerkes at populasjonene av P. infestans i det nordlige Mexico er mer klonale og ligner mer på de nordamerikanske populasjonene, noe som kan tyde på at dette er de nye genotypene (Fry et al., 2009).
nord-Amerika
De nordamerikanske populasjonene av P. infestans har alltid hatt en veldig enkel struktur, og deres klonale karakter ble etablert lenge før bruk av mikrosatellittanalyse. Fram til 1987 dominerte den klonale linjen US-1 i USA og Canada (Goodwin et al., 1995). På midten av 70-tallet, da metalaxylbaserte soppdrepende midler oppstod, begynte denne klonen å bli erstattet av andre, mer motstandsdyktige genotyper som migrerte fra Mexico (Goodwin et al., 1998). Mot slutten av 90-tallet. US-8 genotypen erstattet fullstendig US-1 genotypen i USA og ble den dominerende klonlinjen på poteter (Fry et al., 2009; Fry et al., 2015). Situasjonen var annerledes med tomater, som stadig inneholdt flere klonlinjer, og deres sammensetning endret seg fra år til år (Fry et al., 2009).
I 2009 brøt det ut en storepidemi av sen rødme i USA på tomater. Et trekk ved denne pandemien var dens nesten samtidige utbrudd mange steder i det nordøstlige USA, og det viste seg å være assosiert med massivt salg av infiserte tomatplanter i store hagesentre (Fry et al., 2013). Avlingstapene var enorme. Mikrosatellittanalyse av de berørte prøvene avslørte at pandemistammen tilhørte klonlinjen US-22 A2-type parring. I 2009 nådde andelen av denne genotypen i den amerikanske befolkningen av P. infestans 80% (Fry et al., 2013). I de påfølgende årene økte andelen av aggressive genotyper US-23 (hovedsakelig på tomater) og US-24 (på poteter) jevnt og trutt i befolkningen, men etter 2011 reduserte påvisningsgraden av US-24 betydelig, og hittil ca. 90% av patogenpopulasjonen USA er representert av genotypen US-23 (Fry et al., 2015).
I Canada, som i USA, på slutten av 90-tallet. den dominerende genotypen US-1 ble fortrengt av US-8, hvis dominerende posisjoner forble uendret frem til 2008. I Canada var det alvorlige sene rødmeepidemier assosiert med salg av infiserte tomatplanter, men de var forårsaket av genotypene US-2009 og US-2010 (Kalischuk et al., 23). Den tydelige geografiske differensieringen av disse genotypene var bemerkelsesverdig: US-8 dominerte de vestlige provinsene i Canada (2012%), mens US-23 dominerte de østlige provinsene (68%). I de påfølgende årene spredte US-8 seg til de østlige regionene, men generelt reduserte andelen i befolkningen litt på bakgrunn av utseendet til genotypene US-83 og US-23 i landet (Peters et al., 22). Til dags dato har US-24 en dominerende posisjon i hele Canada; US-2014 er til stede i British Columbia, mens US-23 og US-8 er til stede i Ontario (Peters, 23).
Dermed er de nordamerikanske populasjonene av P. infestans hovedsakelig klonale linjer. I løpet av de siste 40 årene har antallet oppdagede klonale genotyper nådd 24. Til tross for at stammer av begge parringstyper er til stede i befolkningen, er sannsynligheten for at nye genotyper ser ut som et resultat av seksuell rekombinasjon fortsatt ganske lav. I løpet av de siste 20 årene har det imidlertid blitt registrert flere tilfeller av forgjengelige rekombinante populasjoner (Gavino et al., 2000; Danies et al., 2014; Peters et al., 2014), og i ett tilfelle var resultatet av kryssingen genotypen US-11 , som var forankret i Nord-Amerika i mange år (Gavino et al., 2000). Frem til 2009 var endringer i befolkningsstrukturen assosiert med fremveksten av nye, mer aggressive genotyper med deres påfølgende migrasjon og fortrengning av tidligere dominerende forgjengere. Hva skjedde i 2009-2010 i USA og Canada viste epifytotika for første gang at i globaliseringens tid kan sykdomsutbrudd være assosiert med aktiv spredning av nye genotyper når man selger infisert plantemateriale.
sør-Amerika
Inntil nylig var studier av søramerikanske populasjoner av P. infestans verken vanlige eller store. Det er kjent at strukturen til disse populasjonene er ganske enkel og inkluderer 1-5 klonale linjer per land (Forbes et al., 1998). Så innen 1998 var genotypene US-1 (Brasil, Chile) BR-1 (Brasil, Bolivia, Uruguay, Paraguay), EC-1 (Ecuador, Colombia, Peru og Venezuela), AR-1, AR -2, AR-3, AR-4 og AR-5 (Argentina), PE-3 og PE-7 (sørlige Peru). Parringstype A2 var til stede i Brasil, Bolivia og Argentina og ble ikke funnet utenfor den boliviansk-peruanske grensen i området Titicaca-sjøen, bak som EC-1 A1-genotypen dominerte i Andesfjellene. På tomater forble US-1 den dominerende genotypen i hele Sør-Amerika.
Situasjonen vedvarte mer eller mindre på 2000-tallet. Et viktig poeng var oppdagelsen av en ny klonalinje EC-2 av A2-typen på ville slektninger av poteter (S. brevifolium og S. tetrapetalum) i Nord-Andesfjellene (Oliva et al., 2010). Fylogenetiske studier har vist at denne linjen ikke er helt identisk med P. infestans, selv om den er nært beslektet med den, ble det i denne forbindelse foreslått å vurdere den, så vel som en annen linje, EC-3, isolert fra tomatreet S. betaceum som vokser i Andesfjellene, en ny art som heter P. andina; imidlertid er statusen til denne arten (en uavhengig art eller en hybrid av P. infestans med en eller annen ukjent linje) fremdeles uklar (Delgado et al., 2013).
For tiden er alle søramerikanske populasjoner av P. infestans klonale. Til tross for tilstedeværelsen av begge typer parring, har ingen rekombinante populasjoner blitt identifisert. På tomater er US-1-genotypen allestedsnærværende, tilsynelatende fordrevet fra poteter av lokale stammer, hvor den eksakte opprinnelsen fortsatt er ukjent. I Brasil, Bolivia og Uruguay er BR-1-genotypen til stede; i Peru, sammen med US-1 og EC-1, er det flere andre lokale genotyper. I Andesfjellene beholdes den dominerende posisjonen av klonlinjen EC-1, forholdet til den nylig oppdagede P. andina forblir uutforsket. Det eneste "ustabile" stedet der for perioden 2003-2013. det var betydelige endringer i befolkningen, ble Chile (Acuña et al., 2012), der i 2004-2005. patogenpopulasjonen ble preget av motstand mot metalaxyl og en ny mitokondriell DNA-haplotype (Ia i stedet for tidligere tilstedeværende Ib). 2006 til 2011 I befolkningen dominerte genotype 21 (ifølge SSR), hvis andel nådde 90%, hvorpå håndflaten gikk til genotype 20, hvor hyppigheten av forekomst de neste to årene ble holdt på rundt 67% (Acuña, 2015).
Europa
I Europas historie har det vært minst to migrasjonsbølger av P. infestans fra Nord-Amerika: på 1-tallet. (HERB-1) og tidlig på 70-tallet (US-1). Den allestedsnærværende distribusjonen av metallaksylholdige soppdrepende midler på XNUMX-tallet. førte til forskyvning av den dominerende genotypen US-XNUMX og erstatning med nye genotyper. Som et resultat, i de fleste land i Vest-Europa, var patogenpopulasjonene hovedsakelig representert av flere klonlinjer.
Bruk av mikrosatellittanalyse for analyse av patogenpopulasjoner gjorde det mulig å avdekke alvorlige endringer som skjedde i Vest-Europa i 2005-2008. I 2005 ble det oppdaget en ny klonal linje i Storbritannia, kalt 13_A2 (eller “Blue 13”) og preget av parringstypen A2 , høy aggressivitet og motstand mot fenylamider (Shaw et al., 2007). Den samme genotypen ble funnet i prøver samlet i 2004 i Nederland og Nord-Frankrike, noe som antydet at den vandret til Storbritannia fra det kontinentale Europa, muligens med settepoteter (Cooke et al., 2007). Studien av genomet til representanter for denne klonlinjen viste en høy grad av polymorfisme av sekvensen (innen 2016 nådde antallet subklonale variasjoner 340) og en betydelig grad av variasjon i nivået på genuttrykk, inkl. effektorgener under planteinfeksjon (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017). Disse funksjonene, sammen med den økte varigheten av den biotrofiske fasen, kan forårsake en økt aggressivitet på 13_A2 og dens evne til å infisere selv potetvarianter som er motstandsdyktige mot sen rødme.
I løpet av de neste årene spredte genotypen seg raskt over landene i Nordvest-Europa (Storbritannia, Irland, Frankrike, Belgia, Nederland, Tyskland) med samtidig forskyvning av de tidligere dominerende genotypene 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry et al., 2010; Gisi et al. , 2011; Van den Bosch et al., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). I følge nettstedet www.euroblight.net nådde andelen av 13_A2 i befolkningen i disse landene 60-80% og mer; tilstedeværelsen av denne genotypen er også registrert i noen land i Øst- og Sør-Europa. Imidlertid i 2009-2012. 13_A2 mistet sine dominerende posisjoner i Storbritannia og Frankrike, og ga etter for 6_A1-linjen (8_A1 i Irland), og i Nederland og Belgia ble den delvis erstattet av genotyper 1_A1, 6_A1 og 33_A2 (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Til dags dato er rundt 70% av den vesteuropeiske befolkningen av P. infestans monoklonale. I følge nettstedet www.euroblight.net er de dominerende genotypene i landene i Nordvest-Europa (Storbritannia, Frankrike,
Nederland, Belgia) forblir, omtrent i like store mengder, 13_A2 og 6_A1, sistnevnte praktisk talt ikke funnet utenfor den spesifiserte regionen (med unntak av Irland), men har allerede minst 58 underkloner (Cooke, 2017). Variasjoner 13_A2 er tilstede i merkbart antall i Tyskland, og blir også sporadisk observert i landene i Sentral- og Sør-Europa. Genotype 1_A1 utgjør en betydelig del av befolkningen i Belgia og delvis Nederland og Frankrike. Genotype 8_A1 har stabilisert seg i den europeiske befolkningen på nivået 3-6%, med unntak av Irland, der den beholder sin ledende posisjon og er delt inn i to underkloner (Stellingwerf, 2017). Til slutt ble det i 2016 registrert en økning i hyppigheten av forekomst av nye genotyper 36_A2 og 37_A2, først registrert i 2013-2014; til dags dato er disse genotypene funnet i Nederland og Belgia og delvis i Frankrike og Tyskland, så vel som i den sørlige delen av Storbritannia (Cooke, 2017). Omtrent 20-30% av den vesteuropeiske befolkningen representeres av unike genotyper hvert år.
I motsetning til Vest-Europa, da 13_A2-genotypen dukket opp, var befolkningen i Nord-Europa (Sverige, Norge, Danmark, Finland) ikke representert av klonale linjer, men av et stort antall unike genotyper (Brurberg et al.,
2011). I perioden med aktiv spredning av 13_A2 i Vest-Europa ble tilstedeværelsen av denne genotypen i Skandinavia ikke registrert før i 2011, da den først ble oppdaget i Nordjylland (Danmark), hvor hovedsakelig industrielle potetsorter dyrkes med aktiv bruk av metallaksylholdige soppdrepende midler (Nielsen et al., 2014). I følge www.euroblight.net ble genotype 13_A2 også påvist i flere prøver fra Norge og Danmark i 2014 og i flere norske prøver i 2016; i tillegg ble det i 2013 registrert tilstedeværelsen av genotype 6_A1 i liten mengde i Finland. Hovedårsaken til svikt i 13_A2 og andre klonlinjer i erobringen av Skandinavia anses å være klimaforskjellene i denne regionen fra landene i Vest-Europa.
I tillegg til at kjølige somre og kalde vintre fremmer overlevelsen av ikke så mye vegetativt mycelium som oosporer (Sjöholm et al., 2013), bidrar jordfrysing om vinteren (som vanligvis ikke forekommer i varmere land i Vest-Europa) til synkronisering av spiring og beplantning av oosporer. poteter, som forbedrer deres rolle som kilde til primær infeksjon (Brurberg et al., 2011). Det bør også bemerkes at utviklingen av infeksjon fra oosporer under nordlige forhold overgår utviklingen av tuberøs infeksjon, som til slutt forhindrer dominansen av enda mer aggressive, men senere utviklede klonlinjer (Yuen, 2012). Strukturen til de mest studerte populasjonene av P. infestans i landene i Øst-Europa (Polen, de baltiske statene) er veldig lik den i Skandinavia.
Begge typer parring er også tilstede her, og de aller fleste genotyper bestemt av SSR-analyse er unike (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Som i Nord-Europa påvirket distribusjonen av klonlinjer (primært av 13_A2-genotypen) praktisk talt ikke de lokale populasjonene av patogenet, som beholder et høyt mangfoldsnivå uten fravær av uttalte dominerende linjer.
Tilstedeværelsen av 13_A2 observeres tidvis i felt med kommersielle potetsorter. I Russland utvikler situasjonen seg på en lignende måte. Mikrosatellittanalyse av P. infestans isolater samlet i 2008-2011 i 10 forskjellige regioner i den europeiske delen av Russland, viste en høy grad av genotypisk mangfold og en fullstendig mangel på tilfeldigheter med europeiske klonlinjer (Statsyuk et al., 2014). Flere år senere viste en studie av P. infestans-prøver samlet i Leningrad-regionen i 2013-2014 signifikante forskjeller mellom dem og genotypene fra denne regionen identifisert i forrige studie. I begge studiene ble det ikke funnet noen vesteuropeiske genotyper (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2016).
Det høye genetiske mangfoldet i de østeuropeiske populasjonene av P. infestans og fraværet av dominerende klonlinjer i dem kan være relatert til flere grunner. For det første, som i Nord-Europa, bidrar klimaforholdene i de vurderte landene til dannelsen av oosporer som en primær infeksjonskilde (Ulanova et al., 2010; Chmielarz et al., 2014). For det andre dyrkes en betydelig andel poteter produsert i disse landene på små private gårder, ofte omgitt av skog eller andre hindringer for fri bevegelse av smittsomt materiale (Chmielarz et al., 2014). Som regel blir poteter dyrket under slike forhold praktisk talt ikke behandlet med kjemikalier, og valg av varianter er basert på deres motstand mot sen rødme, dvs. det er ikke noe selektivt press for aggressivitet og motstand mot metalaxyl, noe som fratar resistente genotyper, som 13_A2, fordeler i forhold til andre genotyper (Chmielarz et al., 2014). Til slutt, på grunn av den lille størrelsen på tomter, praktiserer eierne vanligvis ikke avling, og dyrker poteter i årevis på samme sted, noe som bidrar til akkumulering av et genetisk mangfoldig inokulum (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
Asia
Inntil nylig var strukturen til P. infestans befolkninger i Asia relativt dårlig forstått. Det var kjent at det hovedsakelig er representert av klonale linjer, og effekten av seksuell rekombinasjon på fremveksten av nye genotyper er veldig liten. Så for eksempel i 1997-1998. I den asiatiske delen av Russland (Sibir og Fjernøsten) var patogenpopulasjonen representert av bare tre genotyper med overvekt av SIB-1-genotypen (Elansky et al., 2001). Tilstedeværelsen av klonale patogenlinjer er vist i land som Kina, Japan, Korea, Filippinene og Taiwan (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). Den klonale linjen US-1 dominerte over et stort territorium i Asia på slutten av 90-tallet - tidlig på 2000-tallet. nesten overalt begynte å bli erstattet av andre genotyper, som igjen ga vei for nye. I de fleste tilfeller var endringer i struktur og sammensetning av populasjoner i asiatiske land forbundet med migrasjon av nye genotyper utenfra. Så i Japan, med unntak av JP-3 genotypen, har alle andre japanske genotyper som dukket opp etter US-1 (JP-1, JP-2, JP-3) mer eller mindre bevist ekstern opprinnelse (Akino et al., 2011) ... Det er for tiden tre hovedpatogenpopulasjoner i Kina, med en klar geografisk inndeling; Det er ingen eller veldig svak genflyt mellom disse populasjonene (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). Genotype 13_A2 dukket opp på Kinas territorium i de sørlige provinsene (Yunnan og Sichuan) i 2005-2007, og i 2012-1014. ble også sett nordøst i landet (Li et al., 2013b). I India dukket antagelig 13_A2 opp samtidig i Kina, mest sannsynlig med infiserte settepoteter (Chowdappa et al., 2015), og i 2009-2010. forårsaket en alvorlig epifytose av sen rødme på tomat sør i landet, hvorpå den spredte seg til poteter og i 2014 forårsaket et utbrudd av sen rødme i Vest-Bengal, noe som førte til ruinen og selvmordet til mange lokale bønder (Fry, 2016).
Afrika
Fram til 2008-2010 systematiske studier av P. infestans i afrikanske land har ikke blitt utført. For øyeblikket kan de afrikanske populasjonene av P. infestans deles inn i to grupper, og denne inndelingen er tydelig assosiert med faktumet om import av settepoteter fra Europa.
I Nord-Afrika, som aktivt importerer settepoteter fra Europa, er paringstypen A2 bredt representert i nesten alle regioner, noe som gir en teoretisk mulighet for fremveksten av nye genotyper som et resultat av seksuell rekombinasjon (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). I tillegg noteres tilstedeværelsen av genotypene 13_A2, 2_A1 og 23_A1 i Algerie med en uttalt dominans av den første av dem, samt en gradvis reduksjon i andelen unike genotyper til fullstendig forsvinning (Rekad et al., 2017). I motsetning til resten av regionen, i Tunisia (med unntak av den nordøstlige delen av landet), er patogenpopulasjonen hovedsakelig representert av A1-parringstypen (Harbaoui et al., 2014).
Den klonale linjen NA-01 er dominerende her. Generelt er andelen klonale linjer i befolkningen bare 43%. I Øst- og Sør-Afrika, hvor volumene av frøimport er forsvinnende små (Fry et al., 2009), er P. infestans bare representert av to klonale A1-linjelinjer, US-1 og KE-1, og sistnevnte fortrenger førstnevnte først på poteter ( Pule et al., 2012; Njoroge et al., 2016). Til dags dato har begge disse genotypene et merkbart antall subklonale variasjoner.
Australia
Den første rapporten om sen rødme på poteter i Australia dateres tilbake til 1907, og den første epifytotien, antagelig forårsaket av kraftig regn i sommermånedene, skjedde i 1909-1911. (Drenth et al., 2002). Generelt har imidlertid sen rødme ingen vesentlig økonomisk betydning for landet. Sporadiske utbrudd av sen rødme, provosert av værforhold som gir høy luftfuktighet, forekommer ikke mer enn en gang hvert 5-7 år og lokaliseres hovedsakelig i Nord-Tasmania og sentrale Victoria. I forbindelse med ovenstående er publikasjoner viet til studiet av strukturen til den australske befolkningen av P. infestans praktisk talt fraværende. Den siste tilgjengelige informasjonen er fra 1998-2000. (Drenth et al., 2002). Ifølge forfatterne var populasjonen i Victoria en klonlinje US-1.3, som indirekte bekreftet migrasjonen av denne genotypen fra USA. Tasmanske prøver ble klassifisert som AU-3, forskjellig fra genotypene som var til stede på den tiden i andre deler av verden.
Funksjoner av utviklingen av senbrann i Russland
I Europa ble infeksjon introdusert med syke frøknoller, oosporer som overvintret i jorden, samt zoosporangia som ble brakt av vinden fra planter dyrket fra overvintrede knoller i fjorårets åker ("frivillige" planter), eller på hauger med avlivet bokmerke for lagring av knoller. Av disse anses planter dyrket på dynger av kasserte knoller som den farligste infeksjonskilden. der er antall spirede knoller ofte betydelig, og zoosporangia kan bæres fra dem over lange avstander. Resten av kildene (oosporer, "frivillige" planter) er ikke så farlige, fordi det er ikke vanlig å dyrke planter i de samme feltene oftere enn en gang hvert tredje år. Infeksjon fra syke frøknoller er også minimal på grunn av et godt frøkvalitetskontrollsystem.
Generelt er mengden av inokulum i europeiske populasjoner begrenset, og derfor er økningen i epidemien ganske langsom og kan med suksess kontrolleres ved bruk av kjemiske soppdrepende midler. Hovedoppgaven under europeiske forhold er kampen mot infeksjon i fasen når massespredningen av zoosporangia fra berørte planter begynner.
I Russland er situasjonen radikalt annerledes. Det meste av potet- og tomatavlingen dyrkes i små private hager; vernetiltak blir enten ikke utført på dem i det hele tatt, eller soppdrepende behandlinger utføres i et utilstrekkelig antall og begynner etter utseendet av sen rødme på toppen. Som et resultat fungerer private grønnsakshager som den viktigste infeksjonskilden, hvorfra zoosporangia bæres av vinden til kommersielle plantinger. Dette bekreftes av våre direkte observasjoner i Moskva, Bryansk, Kostroma, Ryazan-regionene: Skader på planter i private hager observeres allerede før starten på soppdrepende behandlinger av kommersielle plantinger. Deretter blir epidemien i store felt holdt tilbake ved bruk av soppdrepende preparater, mens det i private hager er en rask utvikling av sen rødme.
I tilfelle feil eller "budsjettmessig" prosessering av kommersielle plantinger, vises foci av sen rødme i markene; deretter utvikler de seg aktivt og dekker stadig større områder (Elansky, 2015). Smitte i private hager har en betydelig innvirkning på epidemier i kommersielle felt. I alle potetdyrkende regioner i Russland er området okkupert av poteter i private hager flere ganger større enn det totale arealet av åker av store produsenter. I et slikt miljø kan private grønnsakshager sees på som en global inokulumressurs for kommersielle felt. La oss prøve å identifisere de egenskapene som er karakteristiske for genotypene av stammer i private hager.
Planting av ikke-frø- og karantenekontroll av ware poteter, tomatfrø hentet fra tvilsomme utenlandske produsenter, langvarig dyrking av poteter og tomater på de samme områdene, upassende soppdrepende behandlinger eller deres fullstendige fravær fører til alvorlige epifytotika i privat sektor, hvis resultat er gratis kryssing, hybridisering og dannelse av oosporer i private hager. Som et resultat observeres et veldig høyt genotypisk mangfold av patogenet, når nesten alle stammer er unike i sin genotype (Elansky et al., 2001, 2015). Å plante settepoteter av forskjellige genetiske opprinnelser gjør det lite sannsynlig at klonlinjer som er spesialiserte for å angripe et bestemt utvalg, vil dukke opp. Stammene som er valgt i et slikt tilfelle, kjennetegnes av deres allsidighet i forhold til de berørte variantene, de fleste av dem har nær det maksimale antall virulensgener. Dette er veldig forskjellig fra systemet med "klonale linjer" som er typiske for store felt av landbruksbedrifter med et riktig installert system for beskyttelse mot sen blight. "Klonale linjer" (når alle stammer av senblodspatogenet i feltet er representert med en eller flere genotyper) er allestedsnærværende i land der potetdyrking utføres utelukkende av store gårder: USA, Nederland, Danmark, etc. I England, Irland, Polen, hvor husholdningstomter også tradisjonelt er utbredt potetdyrking, er det også et høyere genotypisk mangfold i private hager. På slutten av 20-tallet var "klonale linjer" utbredt i de asiatiske og fjernøstlige delene av Russland (Elansky et al., 2001), noe som tilsynelatende skyldes bruk av de samme potetvarianter utelukkende til planting. Nylig begynte også situasjonen i disse regionene å endre seg mot en økning i det genotypiske mangfoldet av populasjoner.
Mangelen på intensive behandlinger med soppdrepende preparater har en annen, direkte konsekvens - det er ingen opphopning av resistente stammer i hagene. Faktisk viser resultatene at metallaksylresistente stammer finnes mye sjeldnere i private hager enn i kommersielle beplantninger.
Nærheten til potet- og tomatplantinger, typisk for private hager, letter migrasjon av stammer mellom disse avlingene, som et resultat av det siste tiåret blant stammene isolert fra poteter, andelen stammer som bærer genet for motstand mot kirsebærtomatsorter (T1), som tidligere kun var karakteristisk for tomat "stammer. Stammer med T1-genet er i de fleste tilfeller svært aggressive mot både poteter og tomater.
I de siste årene begynte sent rødme på tomat å vises i mange tilfeller tidligere enn på poteter. Tomatplanter kan infiseres av oosporer i jorda, eller oosporer som er tilstede i tomatfrø eller holder seg til dem (Rubin et al., 2001). I løpet av de siste 15 årene har et stort antall billige frø, hovedsakelig importert, dukket opp i butikkene, og de fleste av de små produsentene har gått over til å bruke dem. Frøene kan gi stammer med genotyper som er typiske for regionene der de vokser. I fremtiden blir disse genotypene inkludert i den seksuelle prosessen i private hager, noe som fører til fremveksten av helt nye genotyper.
Dermed kan det fastslås at private hager er en global "smeltedigel" der, som et resultat av utveksling av genetisk materiale, blir eksisterende genotyper behandlet og helt nye dukker opp. Dessuten foregår deres valg under forhold som er veldig forskjellige fra de som er opprettet for poteter på store gårder: fravær av soppdrepende presse, sort ensartethet av plantinger, overvekt av planter som er påvirket av forskjellige former for viral og bakteriell infeksjon, nærhet til tomater og ville natthatter, aktiv kryssing og oosporedannelse, muligheten for at oosporer skal fungere som en smittekilde neste år.
Alt dette fører til et veldig høyt genotypisk mangfold av bakgårdspopulasjoner. Under epifytotiske forhold sprer sen rødme seg veldig raskt i grønnsakshager og store mengder sporer frigjøres, som flyr til nærliggende kommersielle plantinger. Etter å ha kommet inn i kommersielle felt med riktig system for jordbruksteknologi og kjemisk beskyttelse, har sporene som har kommet, praktisk talt ingen mulighet til å sette i gang epifytotika i feltet, noe som skyldes mangel på klonlinjer som er motstandsdyktige mot soppdrepende midler og spesialiserte seg på den dyrkede sorten.
En annen kilde til primær inokulum kan være syke knoller fanget i kommersielle frøplanter. Disse knollene ble som regel dyrket i felt med god jordbruksteknologi og intensiv kjemisk beskyttelse. Genotypene til isolatene som påvirket knollene er tilpasset utviklingen av deres egen sort. Disse stammene er betydelig farligere for kommersiell beplantning enn inokulum som stammer fra private hager. Denne antagelsen støttes av resultatene av vår forskning. Populasjoner isolert fra store felt med riktig utført kjemisk beskyttelse og god jordbruksteknologi skiller seg ikke ut i høyt genotypisk mangfold. Ofte er dette flere klonale linjer som er svært aggressive.
Stammer fra kommersielt frømateriale kan komme inn i populasjoner i grønnsakshager og være involvert i prosessene som foregår i dem. I en grønnsakshage vil deres konkurranseevne imidlertid være mye lavere enn i et kommersielt felt, og snart vil de slutte å eksistere i form av en klonal linje, men genene deres kan brukes i "hage" -populasjonen.
Infeksjonen som utvikler seg på "frivillige" planter og på hauger med avlivet knoller under høsting, er ikke så relevant for Russland, fordi I de viktigste potetvekstområdene i Russland observeres frysing av dyp vinterjord, og planter fra knoller som har overvintret i jorden utvikler seg sjelden. Videre, som eksperimentene våre viser, overlever ikke den sene røde patogenen ved negative temperaturer selv på knoller som har beholdt levedyktigheten. I den tørre sonen, hvor dyrking av tidlige poteter blir praktisert, er sen kumling ganske sjelden på grunn av den tørre og varme vekstsesongen.
Dermed observerer vi for tiden inndelingen av P. infestans populasjoner i "felt" og "hage" populasjoner. Imidlertid har de siste årene blitt observert prosesser som fører til konvergens og interpenetrasjon av genotyper fra disse populasjonene.
Blant dem kan man merke seg en generell økning i leseferdigheten til små produsenter, utseendet til rimelige småpakker med settepoteter, spredningen av soppdrepende preparater i små pakker, og tapet av frykten for "kjemi" av befolkningen.
Situasjoner oppstår når, takket være den kraftige aktiviteten til en leverandør, hele landsbyer er plantet med frøknoller av samme sort og forsynt med små pakker med de samme plantevernmidlene. Det kan antas at poteter av samme sort vil bli funnet på kommersielle plantinger i nærheten.
På den annen side fremmer noen skadedyrhandelsselskaper "budsjett" kjemiske behandlingsordninger. I dette tilfellet blir antallet anbefalte behandlinger undervurdert og de billigste soppdrepende stoffene tilbys, og det legges ikke vekt på å forhindre utvikling av sen rødme opp til klipping av toppene, men på en viss forsinkelse i epifytoty for å øke utbyttet. Slike ordninger er økonomisk berettiget når dyrking av poteter er laget av frømateriale av lav kvalitet, når det i utgangspunktet ikke er snakk om å oppnå høyt utbytte. Men i dette tilfellet, i motsetning til hagepopulasjonene, bidrar den utjevnede genetiske bakgrunnen til poteten til utvalget av spesifikke fysiologiske raser, som er veldig farlige for denne sorten.
Generelt synes tendenser mot konvergens av "hage" og "felt" -metoder for potetproduksjon for oss ganske farlige. For å forhindre deres negative konsekvenser, både i hjemmet og i kommersiell sektor, vil det være nødvendig å kontrollere både sortimentet av settepoteter og utvalget av soppdrepende midler som tilbys private eiere i små emballasjer, samt spore potetbeskyttelsesordninger og bruken av soppdrepende midler i den kommersielle sektoren.
I områdene til privat sektor er det en intensiv utvikling av ikke bare senbrann, men også Alternaria. De fleste eiere av private husholdningstomter tar ikke spesielle tiltak for å beskytte mot Alternaria, og tar utviklingen av Alternaria for naturlig visning av løvverket eller for utvikling av sen rødme. Derfor, med den enorme utviklingen av Alternaria på mottakelige varianter, kan husholdningstomter tjene som kilde til inokulum for kommersielle plantinger.
Mekanismer for variasjon
Mutasjonsprosess
Siden forekomsten av mutasjoner er en tilfeldig prosess som går med en lav frekvens, avhenger forekomsten av mutasjoner på hvilket som helst sted av hyppigheten av mutasjon av dette stedet og størrelsen på befolkningen. Når man studerer hyppigheten av mutasjoner av P. infestans-stammer, bestemmes vanligvis antall kolonier dyrket på selektive næringsmedier etter behandling med kjemiske eller fysiske mutagener. Som det kan sees av dataene presentert i tabell 8, kan frekvensen av mutasjon av samme belastning på forskjellige steder variere med flere størrelsesordener. Den høye frekvensen av mutasjoner i motstand mot metalaksyl kan være en av årsakene til akkumulering av stammer som er motstandsdyktige mot den i naturen.
Hyppigheten av spontane eller induserte mutasjoner, beregnet på grunnlag av laboratorieeksperimenter, tilsvarer ikke alltid prosessene som forekommer i naturlige populasjoner, av følgende årsaker:
1. Med asynkrone kjernefysiske fisjoner er det umulig å estimere hyppigheten av mutasjoner per kjernefysisk generasjon. Derfor gir de fleste eksperimenter bare informasjon direkte om hyppigheten av mutasjoner, uten å skille mellom to mutasjonshendelser og en hendelse etter mitose.
2. Enkelt-trinns mutasjoner reduserer vanligvis balansen i genomet, og sammen med anskaffelsen av en ny egenskap avtar organismens generelle egnethet. De fleste av de eksperimentelt oppnådde mutasjonene har redusert aggressivitet og registreres ikke i naturlige populasjoner. Dermed var korrelasjonskoeffisienten mellom motstandsgraden til P. infestans mutanter mot fenylamid soppdrepende midler og vekstraten i et kunstig miljø i gjennomsnitt (-0,62), og motstanden mot soppdrepende midler og aggressivitet på potetblader (-0,65) (Derevyagina et al. , 1993), noe som indikerer mutanternes lave kondisjon. Mutasjoner av motstand mot dimetomorf ble også ledsaget av en kraftig reduksjon i levedyktighet (Bagirova et al., 2001).
3. Flertallet av spontane og induserte mutasjoner er recessive og manifesterer seg ikke fenotypisk i eksperimenter, men utgjør en skjult variabilitetsreserve i naturlige populasjoner. Mutantstammer isolert i laboratorieeksperimenter bærer dominerende eller semi-dominante mutasjoner (Kulish og Dyakov, 1979). Tilsynelatende forklarer kjernediploidi mislykkede forsøk på å skaffe mutanter under påvirkning av UV-bestråling som er virulente på tidligere resistente varianter (McKee, 1969). I følge forfatterens beregninger kan slike mutasjoner forekomme med en frekvens på mindre enn 1: 500000 XNUMX. Overgangen av recessive mutasjoner til en homozygot, fenotypisk uttrykt tilstand kan forekomme på grunn av seksuell eller aseksuell rekombinasjon (se nedenfor). Imidlertid, selv i dette tilfellet, kan mutasjonen maskeres av de dominerende allelene til villtypekjernene i det cenotiske (multinukleære) myceliet og bare fenotypisk festes under dannelsen av mononukleære zoosporer.
Tabell 8. Hyppighet av P. infestans mutasjoner til veksthemmende stoffer under påvirkning av nitrosometylurea (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
Tilkobling | Mutasjonsfrekvens |
Oksytetrasyklin | 6,9 10 x-8 |
Blasticidin S | 7,2 x 10-8 |
Streptomycin | 8,3 x10-8 |
Trichothecin | 1,8 10 x-8 |
Sykloheksimid | 2,1 10 x-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Dimethomorph | 6,3 10 x-7 |
Metalaxil | 6,9 10 x-6 |
Befolkningsstørrelser spiller også en avgjørende rolle i forekomsten av spontane mutasjoner. I veldig store populasjoner, hvor antall celler N> 1 / a, hvor a er mutasjonshastigheten, slutter mutasjon å være et tilfeldig fenomen (Kvitko, 1974).
Beregninger viser at med en gjennomsnittlig angrep av en potetåker (35 flekker per plante) dannes 8x1012 sporer daglig på en hektar (Dyakov og Suprun, 1984). Tilsynelatende inneholder slike populasjoner alle mutasjoner tillatt av typen utveksling på hvert sted. Selv en sjelden mutasjon, som forekommer med en frekvens på 10-9, vil bli anskaffet av tusen individer av millioner som lever på en hektar potetåker. For mutasjoner som forekommer med en høyere frekvens (for eksempel 10-6), i en slik populasjon, kan forskjellige sammenkoblede mutasjoner forekomme daglig (samtidig på to steder), dvs. mutasjonsprosessen vil erstatte rekombinasjon.
Migrasjoner
For P. infestans er to hovedtyper av migrasjon kjent: å lukke avstander (innenfor en potetåker eller nærliggende felt) ved å spre zoosporangia med luftstrømmer eller regnspray, og til lange avstander - med å plante knoller eller transporterte tomatfrukter. Den første metoden sørger for utvidelse av sykdomsfokuset, den andre - oppretting av nye foci på steder fjernt fra primærområdet.
Spredning av infeksjon med tomatknoller og frukt bidrar ikke bare til sykdomsutviklingen nye steder, men er også den viktigste kilden til genetisk mangfold i populasjoner. I Moskva-regionen dyrkes poteter, hentet fra forskjellige regioner i Russland og Vest-Europa. Tomatfrukter hentes fra de sørlige områdene i Russland (Astrakhan-regionen, Krasnodar-territoriet, Nord-Kaukasus). Tomatfrø, som også kan tjene som smittekilder (Rubin et al., 2001), importeres også fra de sørlige regionene i Russland, Kina, europeiske land og andre land.
Ifølge beregninger av E. Mayr (1974) overstiger genetiske endringer i en lokal populasjon forårsaket av mutasjoner sjelden 10-5 per lokus, mens i åpne populasjoner er utvekslingen på grunn av motstrømmen av gener minst 10-3 - 10-4.
Migrasjon i infiserte knoller er ansvarlig for at P. infestans kommer inn i Europa, og spres til alle regioner i verden der poteter dyrkes; de forårsaket de mest alvorlige befolkningsendringene. Sen rødme på poteter dukket opp på det russiske imperiets territorium nesten samtidig med utseendet i Vest-Europa.
Siden sykdommen først ble oppdaget i 1846-1847 i de baltiske statene og bare i de påfølgende årene spredte seg i Hviterussland og de nordvestlige regionene i Russland, er dens vesteuropeiske opprinnelse åpenbar. Den første kilden til sen rødme i den gamle verden er ikke så åpenbar. Hypotesen utviklet av Fry et al. (Fry et al., 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin et al., 1994) antyder at parasitten først kom fra Mexico til Nord-Amerika, hvor den spredte seg over avlinger, og deretter ble transportert til Vest-Europa. (fig. 7).
Som et resultat av gjentatt drift (dobbel effekt av "flaskehalsen") kom enkeltkloner til Europa, hvis avkom forårsaket en pandemi over hele den gamle verdens territorium der det dyrkes poteter. Som bevis på denne hypotesen siterer forfatterne for det første allestedsnærheten til bare en type parring (A1) og for det andre homogeniteten til genotypene til de studerte stammene fra forskjellige regioner (alle er basert på molekylære markører, inkludert 2 isozym loci, DNA-fingeravtrykkmønstre, og strukturen til mitokondrie-DNA er identisk, og tilsvarer klonen US-1 beskrevet i USA). Imidlertid reiser noen data tvil om i det minste noen av bestemmelsene i den oppgitte hypotesen. Analyse av P. infestans mitokondrie-DNA isolert fra herbariumpotetprøver smittet i løpet av den første epifytotiske perioden på 40-tallet, viste at de skiller seg i strukturen til mitokondrie-DNA fra klon US-1, som derfor i det minste var minst ikke den eneste smittekilden i Europa (Ristaino et al, 2001).
Senblødningssituasjonen forverret seg igjen på 80-tallet av XX-tallet. Følgende endringer har skjedd:
1) Gjennomsnittlig aggressivitet hos befolkningen har økt, noe som spesielt har ført til utbredelse av den mest skadelige formen for sen rødme - skade på petioles og stilker.
2) Det var et skifte i tiden med sen rødme på poteter - fra slutten av juli til begynnelsen av juli og til og med slutten av juni.
3) Paringstypen A2, som tidligere var fraværende i den gamle verden, ble allestedsnærværende.
Forandringene ble innledet av to hendelser: den massive bruken av det nye soppdrepermetallet metalaxyl (Schwinn og Staub, 1980) og fremveksten av Mexico som en verdenseksportør av poteter (Niederhauser, 1993). I samsvar med dette ble det fremmet to grunner til befolkningsendringer: konvertering av parringstypen under påvirkning av metalaxyl (Ko, 1994) og den massive innføringen av nye stammer med infiserte knoller fra Mexico (Fry og Goodwin, 1995). Selv om konvertering av parringstyper under påvirkning av metalaxyl ble oppnådd ikke bare av Ko, men også i arbeider utført i laboratoriet ved Moscow State University (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), er den andre hypotesen å foretrekke. Sammen med utseendet til den andre typen parring, skjedde alvorlige endringer i genotypene til russiske P. infestans-stammer, inkludert i nøytrale gener (isozym og RFLP loci), så vel som i strukturen til mitokondrie-DNA. Komplekset av disse endringene kan ikke forklares med metallaksylens virkning; det var heller en massiv import av nye stammer fra Mexico, som, fordi de var mer aggressive (Kato et al., 1997), fordrev de gamle stammene (US-1) og ble dominerende i befolkningen. Endringen i sammensetningen av europeiske befolkninger skjedde på veldig kort tid - fra 1980 til 1985 (Fry et al., 1992). På territoriet til det tidligere Sovjetunionen ble "nye stammer" funnet i samlinger fra Estland i 1985, det vil si tidligere enn i Polen og Tyskland (Goodwin et al., 1994). Siste gang den "gamle stammen US-1" i Russland ble isolert fra en infisert tomat i Moskva-regionen i 1993 (Dolgova et al., 1997). Også i Frankrike ble det funnet “gamle” stammer i tomatplanting til tidlig på 90-tallet, det vil si etter at de lenge hadde forsvunnet på poteter (Leberton og Andrivon, 1998). Endringer i P. infestans stammer påvirket mange trekk, inkludert de av stor praktisk betydning, og økte skadeligheten av sen rødme.
Seksuell rekombinasjon
For at seksuell rekombinasjon skal bidra til variasjon, er det nødvendig for det første tilstedeværelsen av to typer parring i befolkningen i et forhold nær 1: 1, og for det andre tilstedeværelsen av den opprinnelige populasjonsvariabiliteten.
Forholdet mellom parringstyper varierer sterkt i forskjellige populasjoner og til og med i forskjellige år i en populasjon (Tabell 9,10, 90). Årsakene til slike drastiske endringer i frekvensen av parringstyper i populasjoner (som for eksempel i Russland eller i Israel på begynnelsen av 2002-tallet i forrige århundre) er ukjente, men det antas at dette skyldes innføring av mer konkurransedyktige kloner (Cohen, XNUMX).
Noen indirekte data indikerer løpet av den seksuelle prosessen i visse år og i visse regioner:
1) Studier av populasjoner fra Moskva-regionen viste at i 13 populasjoner hvor andelen av paringstypen A2 var mindre enn 10%, var det totale genetiske mangfoldet beregnet for tre isozyme loci 0,08, og i 14 populasjoner der andelen A2 overskredet 30% var genetisk mangfold dobbelt så høyt (0,15) (Elansky et al., 1999). Dermed jo høyere sannsynligheten for samleie er, desto større er det genetiske mangfoldet i befolkningen.
2) Forholdet mellom forholdet mellom parringstyper i populasjoner og intensiteten av oosporedannelse ble observert i Israel (Cohen et al., 1997) og i Holland
(Flier et al., 2004). Våre studier har vist at oosporer ble funnet i henholdsvis 2, 62, 17 og 9% av de analyserte potetbladene (med 6 eller flere flekker) i populasjoner der isolater med A78-parringstypen utgjorde 50, 30, 15 og 2%.
Prøver med 2 eller flere flekker inneholdt mye mer sannsynlighet for oosporer enn prøver med 1 flekk (henholdsvis 32 og 14% av prøvene) (Apryshko et al., 2004).
Oosporer var mye mer vanlig i bladene på det midterste og nedre laget av potetplanten (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) I noen regioner er unike genotyper blitt oppdaget, forekomsten av disse er assosiert med seksuell rekombinasjon. Således, i Polen i 1989 og i Frankrike i 1990, stammer homozygot for glukose-6-
fosfatisomerase (GPI 90/90). Siden tidligere bare 10/90 heterozygoter ble påtruffet i 100 år, tilskrives homozygositet seksuell rekombinasjon (Sujkowski et al., 1994). I Colombia (USA) er isolater som kombinerer A2 med GPI 100/110 og A1 med GPI 100/100 vanlige, men på slutten av 1994-sesongen (16. august og 9. september) er stammer med rekombinante genotyper (A1 GPI 100/110 og A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) I noen populasjoner fra Polen (Sujkowski et al., 1994) og Nord-Kaukasus (Amatkhanova et al., 2004) tilsvarer fordelingen av fingeravtrykk DNA loci og allozymprotein loci Hardy-Weinberg-fordelingen, som indikerer
om den høye andelen av bidraget fra seksuell rekombinasjon til variasjonen av populasjoner. I andre regioner i Russland ble det ikke funnet noen korrespondanse med Hardy-Weinberg-fordelingen i populasjoner, men tilstedeværelsen av koblingsforvekt ble vist, noe som indikerer overvekt av klonal reproduksjon (Elansky et al., 1999).
5) Genetisk mangfold (GST) mellom stammer med forskjellige parringstyper (A1 og A2) var lavere enn mellom forskjellige populasjoner (Sujkowski et al., 1994), noe som indirekte indikerer seksuelle kryss.
Samtidig kan ikke seksuell rekombinasjon bidra til mangfoldet i befolkningen. Dette bidraget ble beregnet for befolkningene i Moskva-regionen (Elansky et al., 1999). I følge beregningene fra Lewontin (1979) blir “rekombinasjon, som kan produsere nye varianter fra to steder med en frekvens som ikke overstiger produktet av deres heterozygositeter, bare effektiv hvis verdiene for heterozygosity for begge alleler allerede er høye”.
Med forholdet mellom de to typer parring, som er typisk for Moskva-regionen, lik 4: 1, vil rekombinasjonsfrekvensen være 0,25. Sannsynligheten for at kryssede stammer vil være heterozygot for to av de tre studerte isozygote stedene i de studerte populasjonene var 0,01 (2 stammer av 177). Følgelig bør sannsynligheten for forekomst av doble heterozygoter som et resultat av rekombinasjon ikke overstige deres produkt multiplisert med sannsynligheten for kryssing (0,25x0,02x0,02) = 10-4, dvs. seksuelle rekombinanter faller vanligvis ikke inn i den studerte prøven av stammer. Disse beregningene ble gjort for populasjoner fra Moskva-regionen, som er preget av relativt høy variasjon. I monomorfe populasjoner som de sibiriske, kan den seksuelle prosessen, selv om den forekommer i separate populasjoner, ikke påvirke deres genetiske mangfold.
I tillegg er P. infestans preget av hyppig feiljustering av kromosom i meiose, noe som fører til aneuploidi (Carter et al., 1999). Slike brudd reduserer fruktbarheten til hybridene.
Parasexual rekombinasjon, mitotisk genkonvertering
I eksperimenter med spleising av P. infestans stammer med mutasjoner i motstand mot forskjellige veksthemmere, ble fremveksten av misolater resistente mot begge hemmere funnet (Shattock og Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Stammer motstandsdyktige mot to veksthemmere oppsto som et resultat av heterokaryotisering av myceliet, og i dette tilfellet spaltet de under reproduksjon av mononukleære zoosporer (Judelson, Ge Yang, 1998), eller spaltet ikke i monozoosporøse avkom, fordi de hadde tetraploid (siden de første isolatene er diploide) kjerner (K 1979). Heterozygote diploider segregerte med svært lav frekvens på grunn av haploidisering, kromosom-ikke-adskillelse og mitotisk kryssing (Poedinok et al., 1982). Hyppigheten av disse prosessene kan økes ved hjelp av visse effekter på heterozygote diploider (for eksempel UV-bestråling av spirende sporer).
Selv om dannelsen av vegetative hybrider med dobbelt motstand ikke bare forekommer in vitro, men også i potetknoller infisert med en blanding av mutanter (Kulish et al., 1978), er det ganske vanskelig å vurdere rollen som parasexual rekombinasjon i genereringen av nye genotyper i populasjoner. Hyppigheten av dannelse av segreganter på grunn av haploidisering, ikke-adskillelse av kromosomer og mitotisk kryssing uten spesielle effekter er ubetydelig (mindre enn 10-3).
Forekomsten av homozygote segreganter av heterozygote stammer kan være basert på både mitotisk krysning og mitotisk genkonvertering, som i P. sojae forekommer med en frekvens på 3 x 10-2 til 5 x 10-5 per lokus, avhengig av stammen (Chamnanpunt et al. , 2001).
Selv om hyppigheten av forekomst av heterokaryoner og heterozygote diploider viste seg å være uventet høy (når ti prosent), skjer denne prosessen bare når mutante kulturer oppnådd fra samme stamme blir spleiset. Når du bruker forskjellige stammer isolert fra naturen, forekommer ikke heterokaryotisering (eller forekommer med svært lav frekvens) på grunn av tilstedeværelsen av vegetativ inkompatibilitet (Poedinok og Dyakov, 1981; Anikina et al., 1997b; Cherepennikova-Anikina et al., 2002). Følgelig kan rollen som parasexual rekombinasjon bare reduseres til intraklonal rekombinasjon i heterozygote kjerner og overgangen av individuelle gener til en homozygot tilstand uten en seksuell prosess. Denne prosessen kan være av epidemiologisk betydning i stammer med resessive eller semi-dominerende mutasjoner av soppdrepende motstand. Overgangen til en homozygot tilstand på grunn av den parasexual prosessen vil øke motstanden til bæreren av mutasjonen (Dolgova, Dyakov, 1986).
Innføring av gener
Heterotalliske arter Phytophthora er i stand til å avle med dannelsen av hybrid oosporer (se Vorob'eva og Gridnev, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). Den naturlige hybrid av de to Phytophthora-artene var så aggressiv at den drepte tusenvis av eldere i Storbritannia (Brasier et al., 1999). P. infestans kan forekomme med andre arter av slekten (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum, etc.) på vanlige vertsplanter og i jorda, men det er lite informasjon i litteraturen om muligheten for interspesifikke hybrider. Under laboratorieforhold ble hybrider oppnådd mellom P. infestans og P. Mirabilis (Goodwin og Fry, 1994).
Tabell 9. Andelen P. infestans stammer med A2 parringstype i forskjellige land i verden i perioden 1990 til 2000 (ifølge data fra åpne litteraturkilder og nettsteder www.euroblight.net, www.eucablight.org)
Land | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Hviterussland | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Belgia | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ecuador | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Estland | 8 (12) | ||||||||||
England | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Finland | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Frankrike | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Ungarn | 72 (32) | ||||||||||
Irland | 4 (145) | ||||||||||
Nord. Irland | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Nederland | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Norge | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Peru | 0 (34, 1984 -86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Polen | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Skottland | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Sverige | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Wales | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Korea | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
porselen | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Colombia | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Uruguay | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Marokko | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
Mexico (Toluca) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Tabell 10. Andelen P. infestans stammer med A2 parringstype i forskjellige land i verden i perioden 2000 til 2011
Land | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Østerrike | 65 (83) | ||||||||||
Hviterussland | 42 (78) | ||||||||||
Belgia | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Sveits | 89 (19) | ||||||||||
Czech Republic | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Tyskland | 95 (53) | ||||||||||
Danmark | 48 (52) | ||||||||||
Ecuador | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Estland | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
England | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Finland | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Frankrike | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Ungarn | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Nord. Irland | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Nederland | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Norge | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Peru | 0 (36) | ||||||||||
Polen | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Skottland | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Sverige | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Slovakia | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Wales | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Korea | 46 (26) | ||||||||||
Brasil | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
porselen | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Vietnam | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Dynamikk av den genotypiske sammensetningen av populasjoner
Endringer i den genotypiske sammensetningen av P. infestans-populasjoner kan forekomme under påvirkning av migrasjon av nye kloner fra andre regioner, landbrukspraksis (endring av varianter, anvendelse av soppdrepende midler) og værforhold. Eksterne påvirkninger påvirker forskjellige kloner på forskjellige stadier av livssyklusen. Derfor opplever populasjoner årlig sykliske endringer i frekvensen til genene som er utsatt for seleksjon, på grunn av en endring i den dominerende rollen som gendrift og seleksjon.
Påvirkning av sorten
Nye varianter med effektive gener for vertikal resistens (R-gener) er en kraftig selektiv faktor som velger kloner med komplementære virulensgener i P. infestans-populasjoner. I fravær av uspesifikk motstand i potetvarianten, som hemmer veksten av patogenpopulasjonen, skjer prosessen med å erstatte de dominerende klonene i befolkningen veldig raskt. Etter spredning i Moskva-regionen av Domodedovsky-sorten, som har R3-resistensgenet, økte frekvensen av kloner virulente for denne sorten fra 0,2 til 0,82 på ett år (Dyakov og Derevjagina, 2000).
Imidlertid skjer endringen i frekvenser av virulensgener (patotyper) i populasjoner ikke bare under påvirkning av dyrkede potetvarianter. I Hviterussland frem til 1977 dominerte for eksempel kloner med virulensgenene 1 og 4, som var forårsaket av dyrking av potetsorter med resistensgener R1 og R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). På slutten av 70-tallet på XX-tallet oppstod imidlertid kloner med forskjellige virulensgener og deres kombinasjoner, og de komplementære resistensgenene ble aldri brukt i potetavl (ekstra virulensgener) (Ivanyuk et al., 2002). Årsaken til utseendet til slike kloner skyldes tilsynelatende migrasjon av smittsomt materiale fra Mexico med potetknoller til Europa. Hjemme utviklet disse klonene seg ikke bare på dyrkede poteter, men også på ville arter som hadde en rekke motstandsgener; derfor var kombinasjonen av mange virulensgener i genomet nødvendig for å overleve under disse forholdene.
Når det gjelder varianter med ikke-spesifikk motstand, forsinker de, ved å redusere patogenens reproduksjonshastighet, utviklingen av populasjonene, som, som allerede nevnt, er en funksjon av antall. Siden aggressivitet er polygen, akkumuleres kloner som inneholder et større antall gener for "aggressivitet" jo raskere jo høyere populasjonsstørrelse. Derfor er svært aggressive raser ikke et produkt av tilpasning til dyrkede varianter med ikke-spesifikk motstand, men tvert imot er det mer sannsynlig at de blir oppdaget i plantingen av svært følsomme varianter som er akkumulatorer av parasittsporene.
Dermed ble de mest aggressive befolkningene av P. Infestans funnet i Russland i soner med årlige epifytoties (populasjoner fra Sakhalin, Leningrad og Bryansk regioner). Aggressiviteten til disse populasjonene viste seg å være høyere enn den meksikanske (Filippov et al., 2004).
I tillegg dannes det færre oosporer i bladene av resistente varianter enn i mottakelige (Hanson og Shattock, 1998), det vil si at den uspesifikke motstanden til sorten også reduserer parasittens rekombinasjonsevner og muligheten for alternative overvintringsmetoder.
Påvirkning av soppdrepende midler
Fungicider reduserer ikke bare antall fytopatogene sopp, dvs. påvirke de kvantitative egenskapene til deres populasjoner, men de kan også endre frekvensene til individuelle genotyper, dvs. påvirke den kvalitative sammensetningen av populasjoner. Blant de viktigste indikatorene for populasjoner som endrer seg under påvirkning av soppdrepende midler, er følgende: endringer i resistens mot soppdrepende stoffer, endringer i aggressivitet og virulens og endringer i reproduksjonssystemer.
Påvirkning av soppdrepende midler på bestandigheters aggressivitet og aggressivitet
Graden av slik innflytelse bestemmes først og fremst av typen soppdrepende middel som brukes, som kan deles betinget i polysitt, oligositt og monositt.
Førstnevnte inkluderer mest kontaktsoppmidler. Motstand mot dem (hvis det er mulig i det hele tatt) styres av et stort antall svært svakt ekspressive gener. Disse egenskapene bestemmer fraværet av synlige endringer i resistens hos befolkningen etter behandling med soppdrepende midler (selv om det i noen eksperimenter ble oppnådd en økning i resistens). Sopppopulasjonen bevart etter sprøyting med kontaktsoppmidler består av to grupper av stammer:
1) Stammer bevart i områder av planter som ikke er behandlet med stoffet. Siden det ikke var noen kontakt med soppdreper, endres ikke aggressiviteten og motstanden til disse stammene.
2) Stammer i kontakt med soppdreper, hvis konsentrasjon ved kontaktpunktene var under dødelig. Som nevnt ovenfor endres ikke motstanden til denne delen av befolkningen, men på grunn av den delvis skadelige effekten av soppdreperen, selv i subletal konsentrasjon på metabolismen av soppcellen, den generelle egnetheten og dens parasittiske komponent, aggressivitet, reduseres (Derevyagina og Dyakov, 1990).
Dermed har til og med en del av befolkningen som ikke har dødd, utsatt for kontakt med soppdreper, svak aggressivitet og kan ikke være en kilde til epifytotika. Derfor er forsiktig behandling som reduserer hyppigheten av andelen av befolkningen som ikke er i kontakt med soppdrepende middel, en forutsetning for å lykkes med beskyttende tiltak. Motstand mot oligositt soppdrepende stoffer kontrolleres av flere tilsetningsgener.
Mutasjon av hvert gen fører til en viss økning i resistens, og den totale resistensgraden skyldes tillegg av slike mutasjoner. Derfor skjer økningen i motstand i trinn. Et eksempel på en trinnvis økning i motstand er mutasjoner i motstand mot soppdrepende dimetomorf, som er mye brukt for å beskytte poteter mot sen rødme. Dimetomorfresistens er polygen og additiv. Ett-trinns mutasjon øker motstanden litt.
Hver påfølgende mutasjon reduserer målstørrelsen og følgelig frekvensen av påfølgende mutasjoner (Bagirova et al., 2001). Økningen i gjennomsnittsresistensen for befolkningen etter flere behandlinger med oligosit fungicid skjer trinnvis og gradvis. Hastigheten til denne prosessen bestemmes av minst tre faktorer: hyppigheten av mutasjon av motstandsgener, motstandskoeffisienten (forholdet mellom dødelig dose av en resistent stamme i forhold til en sensitiv) og effekten av mutasjoner i motstandsgener på kondisjon.
Forekomsten av hver påfølgende mutasjon er lavere enn den forrige, så prosessen har en dempende natur (Bagirova et al., 2001). Imidlertid, hvis rekombinasjonsprosesser (seksuelle eller parasexual) forekommer i en populasjon, er det mulig å kombinere forskjellige foreldermutasjoner i en hybridstamme og akselerere prosessen. Derfor får panmixpopulasjoner motstand raskere enn agamiske populasjoner, og i sistnevnte, populasjoner som ikke har vegetative inkompatibilitetsbarrierer raskere enn populasjoner atskilt med slike barrierer. I denne forbindelse akselererer tilstedeværelsen av stammer i populasjoner som avviker i typer parring prosessen med å oppnå motstand mot oligositt soppdrepende midler.
Den andre og tredje faktor bidrar ikke til rask opphopning av dimetomorfresistente stammer i populasjoner. Hver påfølgende mutasjon dobler tilnærmet motstanden, som er ubetydelig, og reduserer samtidig både vekstraten i et kunstig miljø og aggressivitet (Bagirova et al., 2001; Stem, Kirk, 2004). Kanskje det er grunnen til at det praktisk talt ikke er noen resistente stammer blant naturlige P. infestans-stammer, til og med de som er samlet fra potetplantninger behandlet med dimetomorf.
En populasjon behandlet med et oligositt soppdrepende middel vil også bestå av to grupper av stammer: de som ikke har vært i kontakt med soppdreper, og derfor ikke har endret de opprinnelige egenskapene (hvis det finnes resistente stammer blant denne gruppen, vil de ikke akkumulere på grunn av høyere aggressivitet og konkurranseevne til følsomme stammer), og stammer i kontakt med subletale konsentrasjoner av soppdreperen. Det er blant sistnevnte at det er mulig å akkumulere motstandsdyktige stammer, fordi de her har fordeler fremfor følsomme.
Derfor, når det brukes oligositt soppdrepende midler, er det ikke så mye en grundig behandling som er viktig som en høy konsentrasjon av legemidlet, flere ganger høyere enn den dødelige dosen, fordi med trinnvis mutagenese er den opprinnelige motstanden til muterte stammer lav.
Til slutt er mutasjoner i resistens mot monositte soppdrepende stoffer meget uttrykksfulle, det vil si at en mutasjon kan rapportere et høyt motstandsnivå, opp til fullstendig tap av følsomhet. Derfor skjer økningen i motstand hos populasjoner veldig raskt.
Et eksempel på slike soppdrepende midler er fenylamider, inkludert det vanligste soppdrepende stoffet, metallaksyl. Motasjoner av motstand mot det oppstår med høy frekvens, og graden av motstand hos mutanter er veldig høy - den overstiger den følsomme belastningen med en faktor tusen eller mer (Derevyagina et al., 1993). Selv om veksthastigheten og aggressiviteten til resistente mutanter avtar på bakgrunn av døden av følsomme stammer fra et systemisk soppdrepende middel, vokser antallet av den resistente populasjonen raskt, og parallelt øker dens aggressivitet. Derfor, etter flere år med bruk av soppdreper, kan aggressiviteten til resistente stammer ikke bare tilsvare aggressiviteten til sensitive, men også overgå den (Derevyagina og Dyakov, 1992).
Effekt på seksuell rekombinasjon
Siden den hyppige forekomsten av A2-parringstypen i P. infestans-populasjoner falt sammen med den intense bruken av metalaxyl mot sen røde, ble det antatt at metalaxyl induserer parringstypekonvertering. I P. parasitica ble en slik omdannelse under påvirkning av kloroneb og metalaksyl eksperimentelt bevist (Ko, 1994). En enkelt passasje på et medium med lav konsentrasjon av metallaksyl førte til fremveksten av homotalliske isolater fra en stamme av P. infestans følsomme for metalaksyl med parringstype A1 (Savenkova og Cherepnikova-Anikina, 2002). Under påfølgende passeringer på medier med en høyere konsentrasjon av metalaxyl ble det ikke påvist et enkelt isolat av A2-parringstypen, men de fleste isolater, når de krysset med A2-isolater, i stedet for oosporer, dannet stygge myceliumakkumuleringer og var sterile. Gjennomganger av en motstandsdyktig stamme med A2-parringstype på medier med høy konsentrasjon av metalaxyl tillot oss å oppdage tre former for parringstypeendringer: 1) fullstendig sterilitet når de krysses med A1- og A2-isolater; 2) homotallisme (dannelsen av oosporer i monokultur); 3) konvertering av A2 parringstype til A1. Metalaxyl kan således forårsake endringer i parringstypene i P. infestans-populasjoner og følgelig forekomsten av seksuell rekombinasjon i dem.
Effekter på vegetativ rekombinasjon
Noen gener for antibiotikaresistens økte frekvensen av hyphal heterokaryotization og atom diploidization (Poedinok og Dyakov, 1981). Som nevnt tidligere forekommer heterokaryotisering av hyfer under fusjon av forskjellige stammer av P. infestans svært sjelden på grunn av fenomenet vegetativ inkompatibilitet i denne soppen. Imidlertid kan gener for resistens mot noen antibiotika ha bivirkninger, uttrykt i å overvinne vegetativ inkompatibilitet. Denne egenskapen var besatt av 1S-1-mutant streptomycin-resistensgenet. Tilstedeværelsen av slike mutanter i feltpopulasjonene av phytophthora kan øke generstrømmen mellom stammer og akselerere tilpasningen av hele populasjonen til nye varianter eller soppdrepende midler.
Visse soppdrepende midler og antibiotika kan påvirke hyppigheten av mitotisk rekombinasjon, noe som også kan endre genotypefrekvenser i populasjoner. Det mye brukte soppdrepende benomylen binder seg til beta-tubulin, et protein som mikrotubuli i cytoskjelettet er bygget av, og forstyrrer derved prosessene for kromosomseparasjon i anafasen av mitose, og øker frekvensen av mitotisk rekombinasjon (Hastie, 1970).
Soppdrepende middel para-fluorfenylalanin, brukt til å behandle nederlandsk sykdom hos alm, har samme egenskap. Para-fluorfenylalanin økte hyppigheten av rekombinasjon i heterozygote diploider P. infestans (Poedinok et al., 1982).
Sykliske endringer i den genotypiske sammensetningen av populasjoner i livssyklusen til P. infestans
Den klassiske utviklingssyklusen til P. infestans i den tempererte sonen består av 4 faser.
1) Fase av eksponentiell vekst av befolkningen (polysyklisk fase) med korte generasjoner. Denne fasen begynner vanligvis i juli og varer 1,5-2 måneder.
2) Fasen med å stoppe veksten av befolkningen på grunn av en kraftig reduksjon i andelen upåvirket vev eller utbruddet av ugunstige værforhold. Denne fasen i gårder som utfører tidlig fjerning av bladfjerning, faller ut av den årlige syklusen.
3) Fasen av overvintring i knoller, ledsaget av en signifikant reduksjon i populasjonsstørrelsen på grunn av utilsiktet infeksjon av knoller, langsom utvikling av infeksjon i dem, fravær av nyinfeksjon av knoller, rotting og avlivning av berørte knoller under normale lagringsforhold.
4) Fasen med langsom utvikling i jord og på frøplanter (monosyklisk fase), hvor generasjonstiden kan nå en måned eller mer (sent i mai - begynnelsen av juli). Vanligvis på dette tidspunktet er syke blader vanskelig å oppdage, selv med spesielle observasjoner.
Fase av eksponensiell befolkningsvekst (polysyklisk fase)
Tallrike observasjoner (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) viste at i begynnelsen av epifytoti dominerer lavvirulente og litt aggressive kloner, som senere erstattes av mer virulente og aggressive. vekstraten for befolkningens aggressivitet er jo høyere, desto mindre motstandsdyktig er variasjonen av vertsplanten.
Når populasjonen vokser, øker konsentrasjonen av både selektivt viktige gener introdusert i kommersielle varianter (R1-R4) og selektivt nøytral (R5-R11). I befolkningen i nærheten av Moskva i 1993 økte den gjennomsnittlige virulensen fra slutten av juli til midten av august fra 8,2 til 9,4, og den største økningen ble observert for det selektivt nøytrale virulensgenet R5 (fra 31 til 86% av virulente kloner) (Smirnov, 1996 ).
En reduksjon i veksthastigheten til en befolkning er ledsaget av en reduksjon i den parasittiske aktiviteten til befolkningen. Derfor, i depressive år, er både det totale antall løp og andelen høyt virulente løp lavere enn i epifytotiske (Borisenok, 1969). Hvis på høyden av epifytotiske værforhold skifter til ugunstig for senblødning og potetangrep avtar, reduseres også konsentrasjonen av svært virulente og aggressive kloner (Rybakova et al., 1987).
Økningen i frekvensen av gener som påvirker virulens og aggressivitet hos befolkningen, kan skyldes utvalget av mer virulente og aggressive kloner i den blandede populasjonen. For å demonstrere utvalget ble det utviklet en metode for analyse av nøytrale mutasjoner, som ble brukt med hell i kjemostatpopulasjoner av gjær (Adams et al., 1985) og Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995).
Hyppigheten av mutanter som er resistente mot blasticidin S i feltpopulasjonen til P. infestans, gikk ned parallelt med veksten i aggressiviteten til populasjonen, noe som indikerer en endring i de dominerende klonene i prosessen med befolkningsvekst (Rybakova et al., 1987).
Vinterfase i knoller
Under overvintring i potetknoller reduseres virulens og aggressivitet av P. infestans stammer, og nedgangen i virulens skjer saktere enn aggressivitet (Rybakova og Dyakov, 1990). Tilsynelatende er "ekstra" virulensgener og høy aggressivitet nyttige under betingelser som bidrar til den raske veksten av populasjonsstørrelsen (r-seleksjon), og derfor blir utviklingen av epytytika ledsaget av utvalget av de mest virulente og aggressive klonene. Under forhold med metning av miljøet, når ikke reproduksjonshastigheten, men vedvarende eksistens under ugunstige forhold (K-utvalg) spiller en viktig rolle, "ekstra" gener av virulens og aggressivitet reduserer kondisjon, og kloner med disse genene er de første til å dø ut, slik at gjennomsnittlig aggressivitet og befolkningens virulens faller.
Vegetasjonsfase i jord
Denne fasen er den mest mystiske i livssyklusen (Andrivon, 1995). Dens eksistens er postulert rent spekulativt - på grunn av mangel på informasjon om hva som skjer med patogenet over en lang periode (noen ganger mer enn en måned) - fra fremveksten av potetplanter til utseendet på de første flekkene av sykdommen på dem. På grunnlag av observasjoner og eksperimenter ble soppens oppførsel i denne livsperioden rekonstruert (Hirst og Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
Sporulering av soppen kan dannes på infiserte knoller i jorden. De resulterende sporene spiser med hyfer, som kan vegetere lenge i jorden. Primære (dannet på knoller) og sekundære (på myceliet i jorda) sporer stiger opp til jordoverflaten med kapillærstrømmer, men får evnen til å infisere poteter først etter at de nedre bladene kommer ned og kommer i kontakt med jordoverflaten. Slike blader (nemlig de første flekkene av sykdommen finnes på dem) dannes ikke umiddelbart, men etter langvarig vekst og utvikling av potetplater.
I livssyklusen til P. infestans kan den saprotrofiske vegetasjonsfasen også eksistere. Hvis aggressivitet er den viktigste komponenten i kondisjon i den parasittiske fasen av livssyklusen, er valg i den saprotrofiske fasen rettet mot å redusere parasittegenskaper, som eksperimentelt vist for noen fytopatogene sopp (se Carson, 1993). Derfor, i denne fasen av syklusen, bør aggressive egenskaper gå tapt mest intensivt. Men så langt er det ikke utført direkte eksperimenter for å bekrefte ovennevnte forutsetninger.
Sesongmessige endringer påvirker ikke bare de patogene egenskapene til P. infestans, men også motstanden mot soppdrepende midler, som vokser i polysyklisk fase (under epifytoties), og avtar under vinterlagring (Derevyagina et al., 1991; Kadish og Cohen, 1992). Et spesielt intensivt fall i motstand mot metalaxyl ble observert i perioden mellom plantingen av de berørte knollene og utseendet til de første flekkene av sykdommen i feltet.
Intraspesifikk spesialisering og dens utvikling
P. infestans forårsaker epidemier i to kommersielt viktige avlinger, poteter og tomat. Epifytoties på poteter begynte kort tid etter at soppen kom inn i nye områder. Tomatens nederlag ble også bemerket kort tid etter at infeksjonen kom på poteter, men epifytoties på tomat ble notert bare hundre år senere - i midten av det XNUMX. århundre. Her er hva Hallegli og Niederhauser skriver om tomatnederlaget i USA
(1962): ”I omtrent 100 år etter den alvorlige epifytotien i 1845 ble det gjort få eller nesten ingen forsøk på å skaffe resistente varianter av tomat. Selv om sen rødhet først ble registrert på tomater så tidlig som i 1848, ble det ikke gjenstand for alvorlig oppmerksomhet fra oppdrettere på denne planten før et sterkt utbrudd av sykdommen i 1946. På territoriet til Russland ble det registrert sen rødme av tomat på 60-tallet. - I lang tid fulgte ikke forskerne denne sykdommen, siden den ikke forårsaket betydelig økonomisk skade. Men på 70- og 1979-tallet. XX-tallet epifytoties av sen rødme på tomat observeres også i Sovjetunionen, hovedsakelig i Nedre Volga-regionen, i Ukraina, Nord-Kaukasus, i Moldova ... ”(Balashova, XNUMX).
Siden den gang har tomatskader etter senskader blitt årlige, spredt over hele territoriet til industriell og hjemmearbeid og forårsaker enorm økonomisk skade på denne avlingen. Hva skjedde? Hvorfor skjedde det første utseendet til parasitten på poteter og den epifytotiske lesjonen av denne kulturen nesten samtidig, mens det tok et århundre før epifytotikum dukket opp på tomaten? Disse forskjellene støtter en meksikansk enn en søramerikansk infeksjonskilde. Hvis arten Phytophthora infestans dannet som en parasitt av meksikanske knollbærende arter av slekten Solanum, er det forståelig hvorfor dyrkede poteter som tilhører samme del av slekten som den meksikanske arten ble så sterkt påvirket, men på grunn av fravær av coevolusjon med parasitten, som ikke utviklet mekanismer for spesifikk og ikke-spesifikk motstand.
Tomaten tilhører en annen seksjon av slekten, utvekslingstypen har betydelige forskjeller fra den knollformede arten, derfor til tross for at tomaten ikke er utenfor matvarespesialiseringen til P. infestans, var intensiteten av nederlaget ikke tilstrekkelig for alvorlige økonomiske tap.
Fremveksten av epifytoties på tomat skyldes alvorlige genetiske endringer i parasitten, noe som økte tilpasningsevnen (patogenisitet) under parasittisme. Vi tror at den nye formen spesialisert for parasitisering av tomaten er T1-løpet beskrevet av M. Gallegly, som påvirker varianter av cherrytomat (Red Cherry, Ottawa), motstandsdyktig mot T0-løpet som er utbredt på poteter (Gallegly, 1952). Tilsynelatende var en mutasjon (eller en serie med mutasjoner) som gjorde T0-løpet til T1-løpet og førte til utseendet til kloner som var veldig tilpasset tomatens nederlag. Som ofte skjer, ble en økning i patogenisitet for en vert ledsaget av en reduksjon i den til en annen, det vil si en innledende, ennå ikke fullstendig intraspesifikk spesialisering oppstod - til poteter (rase T0) og til tomat (rase T1).
Hva er beviset for denne antagelsen?
- Forekomst på poteter og tomater. På tomatblader dominerer T1-løpet, mens det på potetblader er sjeldent. I følge S.F. Bagirova og T.A. Oreshonkova (upublisert) i Moskva-regionen i 1991-1992, forekomsten av T1-løpet i potetplantninger var 0%, og i tomatplantinger - 100%; i 1993-1995 - henholdsvis 33% og 90%; i 2001 - 0% og 67%. Lignende data ble innhentet i Israel (Cohen, 2002). Eksperimenter med infeksjon av potetknoller med isolater fra T1-løpet og en blanding av isolater T0 og T1 viste at isolater fra T1-løpet er dårlig bevart i knoller og erstattes av isolater fra T0-løpet (Dyakov et al., 1975; Rybakova, 1988).
2) Dynamikk av rase T1 i tomatplantinger. Den primære infeksjonen av tomatblader utføres av isolater fra T0-løpet, som dominerer i analysen av infeksjon i de første flekkene som dannes på bladene. Dette bekrefter den generelt aksepterte ordningen for parasittmigrasjonen: Hovedmassen for infeksjon fra poteter består av T0-løpet, men et lite antall T1-kloner som er bevart i poteter, en gang på tomat, fortrenger T0-løpet og akkumulerer mot slutten av den epifytotiske perioden. Det er også mulig at det er en alternativ kilde til infeksjon av tomatblader med T1-løpet, ikke så kraftig som potetknoller og løv, men konstant. Derfor har denne kilden en svak effekt på den genetiske strukturen til befolkningen som smitter tomat, men bestemmer deretter akkumuleringen av T1-løpet (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994).
3) Aggressivitet overfor poteter og tomater. Kunstig infeksjon av tomat- og potetblader med isolater av løp T0 og T1 viste at førstnevnte er mer aggressive for poteter enn for tomat, og sistnevnte er mer aggressive for tomat enn for potet. Disse forskjellene manifesteres i forskyvningen av isolater fra en ikke-"egen" rase fra en blandet befolkning under passasjer på blader i et drivhus (Dyakov et al., 1975) og i feltplott (Leberton et al., 1999); forskjeller i minimum smittsom belastning, ventetid, størrelse på smittsomme flekker og sporproduksjon (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994; Legard et al., 1995; Forbes et al., 1997; Oyarzun et al., 1998; Leberton et al., 1999; Vega-Sanchez et al., 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna et al., 2004).
Aggressiviteten til isolater av T1-løpet mot tomatkultivarer som mangler resistensgener, er så høy at disse isolatene sporer på blader som på et næringsmedium uten å nekrotisere det infiserte vevet (Dyakov et al., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000).
4) Virulens for poteter og tomater. T1-løpet påvirker cherrytomatsorter med Ph1-resistensgenet, mens T0-løpet ikke er i stand til å infisere disse variantene, dvs. har en smalere virulens. I forhold til differensierere
R-gener av poteter er omvendt beslektede, dvs. stammer isolert fra tomatblader er mindre virulente enn "potet" -stammer (tabell 11).
5) Nøytrale markører. Analysen av nøytrale markører i populasjonene av P. infestans som parasiterer på poteter og tomater vitner også om det multidireksjonelle intraspesifikke utvalget. I de brasilianske populasjonene av P. infestans tilhørte tomatbladisolater klonlinjen US-1, og de fra potetblader tilhørte BR-1-linjen (Suassuna et al., 2004). I Florida (USA), siden 1994, begynte klon US-90 å dominere på poteter (med en forekomst på mer enn 8%), og kloner US-11 og US-17 på tomat, og sistnevntes isolater er mer aggressive for tomat enn for potet (Weingartner , Tombolato, 2004). Signifikante forskjeller i genotypefrekvenser (DNA-fingeravtrykk) i potet- og tomatisolater ble etablert for 1200 P. infestans-stammer samlet i USA fra 1989 til 1995 (Deahl et al., 1995).
Ved hjelp av AFLP-metoden var det mulig å skille 74 stammer samlet fra potet- og tomatblader i 1996-1997. i Frankrike og Sveits, i 7 grupper. Potet- og tomatstammene avviker ikke helt klart, men "potet" -stammene var genetisk mer forskjellige enn de "tomat". Førstnevnte ble funnet i alle syv klynger, og sistnevnte bare i fire, noe som indikerer et mer spesialisert genom av sistnevnte (Knapova og Gisi, 2002).
6) Isolasjonsmekanismer. Hvis populasjonen av parasitten på to vertsplantearter utvikler seg mot å begrense spesialiseringen til sin “egen” vert, oppstår forskjellige pre- og postmeiotiske mekanismer som forhindrer genetisk utveksling mellom populasjoner (Dyakov og Lekomtseva, 1984).
Flere studier har undersøkt effekten av kilder til foreldrestammer på effektiviteten av hybridisering. Når stammer isolert fra forskjellige arter av slekten Solanum ble krysset i Ecuador (Oliva et al., 2002), ble det funnet at stammer med paringstypen A2 fra ville nattskygger (klonlinje EC-2) krysset det verste med stammer fra tomat (linje EC -3), og krysset mest effektivt med potetstammen (EC-1).
Alle hybrider ble funnet å være ikke-patogene. Forfatterne mener at den lave prosentandelen av hybridisering og reduksjon av patogenisitet i hybrider skyldes postmeiotiske mekanismer for reproduktiv isolasjon av populasjoner.
I eksperimentene til Bagirova et al. (1998) ble et stort antall potet- og tomatstammer krysset med egenskapene til T0- og T1-løpene. De mest fruktbare kryssene av T1xT1-stammer isolert fra tomat (36 oosporer i synsfeltet i mikroskopet, 44% av oosporens spiring), de minst effektive var kryss av T0xT1-løp isolert fra forskjellige verter (et lavt antall utviklende og spirede oosporer, en høy andel abortive og underutviklede oosporer) ... Effektiviteten av kryssinger mellom isolater fra T0-løpet isolert fra poteter var middels. Siden hoveddelen av stammene i T0-løpet påvirker poteter, har den en pålitelig kilde til overvintring - potetknoller, som et resultat av at oospores betydning som overvintrende smittsomme enheter for populasjoner fra poteter er lav. Den tilpassede “tomatformen” er i stand til å overvintre på tomaten i form av oosporer (se nedenfor) og beholder derfor en høyere produktivitet i den seksuelle prosessen. På grunn av sin høye fruktbarhet får T1 et uavhengig potensial for primær infeksjon i tomat. Resultatene oppnådd av Knapova et al. (Knapova et al., 2002) kan tolkes på samme måte. Kryssene av stammer isolert fra poteter med stammer fra tomat ga det høyeste antall oosporer - 13,8 per kvm. medium (med en spredning på 5-19) og en mellomliggende prosentandel av spiring av oosporer (6,3 med en spredning på 0-24). Kryssing av stammer isolert fra tomat ga den laveste prosentandelen oosporer (7,6 med et spredning på 4-12) med den høyeste prosentandelen av spiring (10,8). Kryssene mellom stammene isolert fra poteter ga et mellomliggende antall oosporer (8,6 med høy spredning av data - 0-30) og den laveste prosentandelen av spiring av oosporer (2,7). Dermed er stammer fra poteter mindre fruktbare enn de fra tomat, men interpopulasjonskryss ga ikke dårligere resultater enn intrapopulation. Det er mulig at forskjellene med ovennevnte data fra Bagirova et al. forklares med det faktum at russiske forskere jobbet med stammer isolert på begynnelsen av 90-tallet av det 90. århundre, og sveitsiske forskere - med stammer isolert på slutten av XNUMX-tallet.
Grunnlaget for lav fruktbarhet kan være heteroploidien til stammene. Hvis i meksikanske populasjoner, der den seksuelle prosessen og den primære infeksjonen med oospore-avkom er regelmessige, er de fleste av de studerte stammene av P. Infestans diploide, så observeres i landene i den gamle verden intrapopulation polymorfisme av ploidy (di-, tri- og tetraploide stammer, så vel som heterokaryotiske stammer med heteroploide kjerner) og stammer som har forskjellige typer parring, dvs. gjensidig fruktbar, avviker i kjernefysisk ploidi (Therrien et al., 1989, 1990; Whittaker et al., 1992; Ritch, Daggett, 1995). Mangfold av kjerner i antheridia og oogonia kan være årsaken til lav fruktbarhet.
Når det gjelder kjernefysisk utveksling mellom hyfer under anastomoser, forhindres dette av vegetativ inkompatibilitet, som deler aseksuelle populasjoner i mange genetisk isolerte kloner (Poedinok og Dyakov, 1987; Gorbunova et al., 1989; Anikina et al., 1997b).
7) Konvergens av populasjoner. Ovennevnte data indikerer at hybridisering mellom "potet" og "tomat" P. infestans stammer er mulig. Gjensidig reinfeksjon av forskjellige verter er også mulig, om enn med redusert aggressivitet.
En studie av populasjonsmarkører i isolater fra tilstøtende potet- og tomatfelt i 1993 viste at omtrent en fjerdedel av isolatene isolert fra tomatblader ble overført fra et nærliggende potetfelt (Dolgova et al., 1997). Teoretisk sett kan det antas at divergensen av populasjoner på to verter vil øke og føre til fremveksten av spesialiserte intraspesifikke former (f.sp. potet og f.sp. tomat), spesielt siden oosporer kan vedvare i planterester (Drenth et al., 1995 ; Bagirova, Dyakov, 1998) og tomatfrø (Rubin et al., 2001). Følgelig har tomater for tiden en kilde til vårregenerering uavhengig av potetknoller.
Alt skjedde imidlertid annerledes. Overvintring med oosporer tillot parasitten å unngå det smaleste stadiet i livssyklusen - det monosykliske vegetasjonsstadiet i jorden, hvor parasittiske egenskaper reduseres, som gradvis gjenopprettes i polysyklisk fase om sommeren.
Tabell 11. Frekvenser av virulensgener til potetdifferensierende varianter i P. infestans stammer
Land | År | Gjennomsnittlig antall virulensgener i stammer | Forfatter | |
fra poteter | fra tomat | |||
Frankrike | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton et al., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Frankrike, Sveits | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002 |
USA | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin et al., 1995 |
USA, Zap. Washington | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance et al., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ecuador | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun et al., 1998 |
Israel | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Russland, Mosk. region | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Russland, forskjellige regioner | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaya og andre. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Primær zoosporangia og zoosporer, som spirer oosporer, har en høy grad av parasittisk aktivitet, spesielt hvis oosporer ble dannet parthenogenetisk under påvirkning av feromoner av en stamme med motsatt type parring. Derfor er det smittsomme materialet på tomatplantene dyrket av frø infisert med oosporer sterkt patogent for både tomat og potet.
Disse endringene førte til en ny restrukturering av befolkningen, uttrykt i følgende viktige endringer fra et epidemiologisk synspunkt:
- Infiserte tomatplanter har blitt en viktig kilde til primær infeksjon av poteter (Filippov, Ivanyuk, personlige meldinger).
- Epifytoties på poteter begynte å bli observert allerede i juni, omtrent en måned tidligere enn vanlig.
- I potetplantinger økte prosentandelen av T1-løpet, som tidligere ble funnet der i ubetydelig mengde (Ulanova et al., 2003).
- Stammer isolert fra tomatblad skilte seg ikke lenger fra potetstammer i virulens på potetdifferentiatorer av virulensgener og begynte å overgå "potet" -stammer i aggressivitet, ikke bare på tomat, men også på poteter (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al. , 2003).
I stedet for divergens var det således en konvergens av populasjoner, fremveksten av en enkelt populasjon på to vertsplanter med høy virulens og aggressivitet for begge artene.
Konklusjon
Så, til tross for mer enn 150 år med intensiv studie av P. infestans, i biologi, inkludert populasjonsbiologien til dette årsaksmidlet til de viktigste sykdommene i kultiverte solanaceous planter, er mye fortsatt ukjent. Det er ikke klart hvordan passering av individuelle stadier av livssyklusen påvirker befolkningenes struktur, hva er de genetiske mekanismene til den kanaliserte variasjonen av aggressivitet og virulens, hva er forholdet mellom reproduksjons- og klonale reproduksjonssystemer i naturlige populasjoner, hvordan vegetativ inkompatibilitet arves, hvilken rolle poteter og tomater har i den primære infeksjonen av disse avlingene hva er deres effekt på parasittens befolkningsstruktur. Inntil nå har slike viktige praktiske spørsmål som de genetiske mekanismene for å endre parasittens aggressivitet eller erosjonen av uspesifikk potetresistens ikke blitt løst. Med utdyping og utvidelse av forskning på potet sent røde, gir parasitten nye utfordringer for forskere. Imidlertid gjør forbedringen av eksperimentelle evner, fremveksten av nye metodiske tilnærminger til manipulering med gener og proteiner oss til å håpe på en vellykket løsning på spørsmålene som stilles.
Artikkelen ble publisert i tidsskriftet "Potato Protection" (nr. 3, 2017)